سطح اسمیر با رد تیازین (۲ دقیقه) به عنوان رنگ زمینه لبریز گردید و مجددا” اسمیر شسته و خشک گردید .(Braon E.J and Sydney M.F., 1990)
برای تایید نهایی به روش ذیل-نلسون رنگ آمیزی گردید.
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۳-۳-۳. رنگآمیزی ذیل-نلسون[۶۹]
اصول
در این روش حرارت دادن لامها، نفوذ بیشتر کاربول فوشین را به درون دیواره سلولی باکتری ها فراهم مینماید. اسید مایکولیک مومها با رنگ بازیک کمپلکسی تشکیل می دهند که اجازه خروج رنگ را از دیواره سلولی را با شستن بوسیله مواد رنگ زدای اسیدی نمیدهند.
مواد مصرفی: فوشین بازیک، اتانول ۹۵ درصد، فنل کریستال، اسید کلریدریک غلیظ، متیلین بلو کلراید
آماده سازی مواد
فوشین: ۳/۰ گرم از فوشین بازیک در ۱۰ میلیلیتر اتانول ۹۵ درصد حل گردید.
فنل: ۵ گرم فنل کریستال در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر حل گردید.
کربول فوشین: تمام محلول فوشین به ۹۰ میلیلیتر از محلول فنل اضافه شد.
اسید الکل: با دقت ۳ میلیلیتر اسید هیدروکلراید غلیظ را به ۹۷ میلیلیتر اتانول ۹۵ درصد افزوده سپس به آرامی مخلوط گردید.
متیلن بلو: ۳/۰ گرم متیلن بلو کلراید در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر حل شد.
مراحل رنگآمیزی
بروی اسلایدها فوشین ریخته و ۵ دقیقه آنها را از روی شعله عبور داده، بطوریکه از روی رنگ بخار بلند شد.
سطح لام را با آب مقطر شسته و در ظرف اسید الکل به مدت ۲-۳ دقیقه قرار داده تا کاملا” رنگبری صورت گرفته شد.
اسمیر مجدد با آب مقطر شسته و خشک گردید.
سطح لام با محلول متیلن بلو آغشته گردید و اجازه داده شد این رنگ ۱ تا ۲ دقیقه برروی سطح لام بماند.
اسمیر مجدد با آب مقطر شستشو داده شد، خشک گردیده و سپس با بزرگنمایی ×۱۰۰ با روغن ایمرسیون مشاهده شد (بهره مند ا.ر.، ۱۳۷۲).
۳-۳-۴. رنگآمیزی کینون (رنگ آمیزی سرد)
اصول
با اضافه نمودن غلظت فوشین بازی و فنل نسبت به غلظتهای آنها در رنگآمیزی ذیل نلسون حرارت دادن لامها، لازم نمی باشد. به همین جهت به آن رنگآمیزی سرد میگویند.
مواد مصرفی: فوشین فنلی کینیون، محلول رنگزدای اسید _ الکل و رنگ زمینه
آماده سازی مواد
فوشین فنلی کینیون: ۴ گرم از فوشین بازیک در ۲۰ میلیلیتر اتانول ۹۵ درصد حل گردید و ۱۰۰ میلیلیتر محلول فنل آبکی به آن اضافه شد.
محلول رنگزدای اسید _ الکل: ۳ میلیلیتر اسید کلریدریک غلیظ به ۱۰۰ میلیلیتر اتانول افزوده و سپس به آرامی مخلوط شد.
رنگ زمینه: ۳/۰ گرم متیلن بلو در ۱۰۰ میلیلیتر آب مقطر حل شد.
مراحل رنگآمیزی
لامها را به مدت ۱۵ دقیقه در ۸۵ درجه سانتی گراد حرارت داده شد تا ثابت شوند.
روی لامها به وسیله فوشین بازیک کینیون پوشانده شد و به مدت ۵ دقیقه در دمای اتاق قرار گرفتند.
لامها با آب بدون یون شسته و خشک شدند.
لامها به وسیله اسید – الکل ۳ دقیقه بیرنگ شدند سپس با آب بدون یون شستشو داده شدند.
لامها مجددا به وسیله اسید – الکل ۲-۱ دقیقه بیرنگ شدند تا هنگامی که هیچ رنگ قرمزی از لام در محلول اسید الکل مشاهده نگردید.
لامها را با آب بدون یون شسته و گوشه هر لام روی دستمال کاغذی قرار گرفت تا مایع سطح لام جذب شود.
لامها با محلول متیلن بلو بمدت ۴ دقیقه پوشانده شد.
لامها با آب بدون یون شسته و خشک گردید.
لامها با عدسی x400 میکروسکوپ سپس با عدسی x1000 جهت بررسی باسیل اسید فاست بررسی گردید .(Braon E.J and Sydney M.F., 1990)
۳-۳-۵. بررسی و آزمایش گسترش
تعداد باسیلهای اسید فست مشاهده شده بصورت جدول زیر گزارش گردید:
جدول۳-۱: نحوه گزارش میکروسکوپی
| تعداد باسلهای اسید فست دیده شده | گزارش |
| ۱) هیچ باسیل | هیچ باسیل اسید فستی دیده نشد |
| ۲) ۱ تا ۲ باسیل اسید فست در ۳۰۰ میدان میکروسکوپی | *± |
