۱ – پلیت و معرفهای کیت به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق گذاشته شد تا به دمای اتاق برسد .
۲ – رقت ۱۰۰ : ۱ از سرمها تهیه شد و به همراه کنترل مثبت و منفی و کالیبراتور به میزان ۱۰۰ میکرولیتر به چاهک ها اضافه شد و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
۳ – به کمک دستگاه Washing ELISA هر پلیت سه بار و هر بار با ۳۰۰ میکرولیتر بافر شستشو به ازا هر چاهک شستشو داده شد .
۴ – پس از تخلیه کامل بافر ، به هر چاهک ۱۰۰ میکرولیتر از آنزیم کونژوگه (پراکسیداز متصل به آنتی هیومن IgG) اضافه شد و ۳۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
۵ – شستشو مطابق بند ۴ تکرار شد.
۶ – پس از تخلیه کامل ، به هر چاهک ۱۰۰ میکرولیتر سوبسترا اضافه شد و به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
۷ – ۱۰۰ میکرولیتر محلول متوقف کننده به هر چاهک اضافه شد.
۸ – جذب نوری در ۴۵۰ نانومتر با طول موج رفرنس ۶۳۰ نانومتر توسط دستگاه ELISA reader اندازه گیری شد و جذب نوری کالیبراتور П معیار تفکیک سرمها قرار گرفت. بر این اساس نسبت جذب نوری سرم به جذب نوری کالیبراتور П محاسبه گردید و سرمهای مثبت ومنفی طبق الگوی زیر تفکیک شد.
۸/۰ > نسبت منفی
۸/۰ < نسبت < 1/1 مرز(مشکوک)
۱/۱ < نسبت مثبت
۳-۱۰- اندازه گیری میزان آنتی بادی IgM با کیت تجاری Euroimmun
مشابه اندازه گیری میزان آنتی بادی IgG با کیت تجاری Euroimmun است بجز اینکه کونژوگه آن آنتی هیومن IgM بود و بجای سه کالیبراتور فقط یک کالیبراتور داشت.
۳-۱۱- برقراری شرایط بهینه به منظور محاسبه Avidity Index Ig
IgG Avidity نیروی چسبندگی بین مولکولهای آنتی بادی و اپی توپ های آنتی ژن است که هر چه از آغاز عفونت گذشته باشد و با گذشت زمان مقدار آن بیشترمی شود بطوریکه عفونت های حاد دارای آویدیته پائین و عفونت های مزمن دارای آویدیته بالا میباشد. محلولهای دناتورانت مثل اوره قادر به شکستن پیوندهای ضعیف بین آنتی ژن وآنتی بادی که در اوایل عفونت ایجاد می شود هستند ولی قادر به شکستن پیوندهای قوی که در عفونت های مزمن دیده میشود نیستند به همین علت در روش ELISA موقع شستشوی چاهک ها، OD Value چاهک های نمونه های حاد موقعی که با محلول اوره شسته می شوند میزان جذب(absorbance) بسیار کمتری نسبت به نمونه های مزمن نشان می دهند.
جهت برقراری شرایط بهینه Avidity ELISA پارامتر های زیر بررسی گردید و بهترین شرایط برای ایجاد اختلاف بین OD های سرمهای فاز حاد و فاز مزمن انتخاب شد .

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

• • • • غلظت های ۴M,5M,6M, 7M ,8M اوره
    • • زمان های شستشوی ۱۵ دقیقه و۳۰ دقیقه و۴۵ دقیقه و ۶۰ دقیقه

     

۳-۱۲- اندازه گیری IgGAvidity Index با بهره گرفتن از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و PUET-GRA6
مواد و وسایل مورد نیاز :
مواد و وسایل مورد نیاز در اندازه گیری IgG Avidity Index با بهره گرفتن از پروتئین های نوترکیب PUET-GRA7 و PUET-GRA6مشابه اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم است.بجز بافر دناتورانت(اوره ۸ مولار)(برای ۵۰۰ میلی لیتر)PH=7.2
PBS 1X 500 میلی لیتر
Tween 20 Sigma 250 میکرولیتر
Urea 240 گرم
روش کار :
روش کار هم مشابه اندازه گیری میزان آنتی بادی به روش الایزای غیر مستقیم میباشد بجز یک شستشوی اضافی یعنی بعد از مرحله ۵ برای هر سرم یک چاهک با PBS و یک چاهک با محلول اوره ۸ مولار به مدت ۳۰ دقیقه همراه با شیکر شستشو داده شد(قبل از اضافه کردن اوره هر چاهک دوبار با محلول PBS شستشو گردید). به منظور محاسبه Avidity Index ، OD Value چاهک شستشو داده شده با محلول اوره را تقسیم کردیم بر OD Value چاهک شستشو داده شده با PBS و نتیجه را ضربدر صد نمودیم.
۳-۱۳- اندازه گیری IgG Avidity Index با بهره گرفتن از کیت تجاری EUROIMMUN
به منظور تعیین Avidity سرمهای جمع آوری شده از آزمایشگاهها و مقایسه با Avidity سرمها با بهره گرفتن از پروتئین های نوترکیب از کیت های تجاری شرکت Euroimmun استفاده گردید.
مواد ووسایل مورد نیاز :

• • • • کیت تجاری IgG Avidity Euroimmun
    • • ELISA reader
    • • سمپلر Multichannel و سر سمپلر
    • • دستگاه Washing ELISA
    • • سرم

     

روش کار :
۱ – پلیت و معرفهای کیت به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق گذاشته شد تا به دمای اتاق برسد .
۲ – رقت ۱۰۰ : ۱ از سرمها تهیه شد و به همراه کنترل (positive control HA & LA) به میزان ۱۰۰ میکرولیتر به چاهک ها اضافه شد و به مدت ۳۰ دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.
۳ – به کمک دستگاه Washing ELISA هر پلیت یک بار و هر بار با ۳۰۰ میکرولیتر بافر شستشو به ازا هر چاهک شستشو داده شد .
۴- پس از تخلیه کامل بافر ، به چاهک یک ردیف ۲۰۰ میکرولیتر محلول اوره(آماده موجود در کیت) و به چاهک ردیف دیگر (برای هر سرم دو چاهک) ۲۰۰ میکرولیتر PBS اضافه شد و به مدت ۱۰ دقیقه در حرارت اتاق انکوبه شد.