۳M Tris-HCl PH: 8.8
۰.۵M Tris-HCl PH: 6.8
SDs 10%
APS 10%
TEMED

الکتروفورز پروتئین با ابعاد ۱۰ cm* 10 cm* 0.8 mm توسط تانک الکتروفورز عمودی پروتئین مدل Mini VERTI GEL2 APELEX و منبع تغذیه مدل PS 304 Mini PacII APELEX انجام گرفت.
۲-۴-۷ آماده‌سازی عصاره‌های پروتئینی جهت الکتروفورز
برای بار گذاری از عصاره‌های پروتئینی به دست آمده روی ژل استفاده شد. از آن جا که لازم بود تا مقدار معین و یکسان از نظر غلظت از همه نمونه‌ها در چاهک‌های ژل ریخته شود در ابتدا سنجش کمی پروتئین‌های استخراج شده طبق روش (Bradford, 1976) همان گونه که در قسمت اندازه گیری پروتئین ذکر شده، انجام گرفت و یکسان سازی و استانداردسازی نمونه‌ها صورت گرفت. سپس به ۱۵ میکرولیتر از هر عصاره پروتئینی (حاوی ۱۲-۵ میکروگرم پروتئین در تکرارهای مختلفی از هر ژل الکتروفورز) مقدار ۶ میکرولیتر بافر نمونه اضافه شد (ترکیب بافر نمونه در پیوست ۸ موجود می‌باشد). پس از آن مخلوط حاصل از عصاره پروتئینی و بافر نمونه (۳۰ میکرولیتر) در چاهک‌ها ریخته شد و تانک الکتروفورز با بافر تانک (lX, pH: 8.3) (ترکیبات بافر تانک در پیوست ۸ است) پر گردید و سپس تانک الکتروفورز به منبع تغذیه متصل و تحت میدان الکتریکی با ولتاژ ۱۰۰ ولت و شدت جریان ۴۰ میلی آمپر به مدت ۳-۲ ساعت، الکتروفورز انجام گرفت.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۴-۸ رنگ آمیزی ژل با نیترات نقره (Silver nitrate staining)
این روش بیشتر از ۱۰۰ بار نسبت به رنگ آمیزی با کوماسی بربلیانت بلوی R250 حساس‌تر و قوی‌تر است و مقادیر بسیار جزئی پروتئین (در حد نانو گرم) را می‌تواند آشکار سازد. این روش براساس اتصال نیترات نقره با پروتئین‌ها در یک pH ضعیف اسیدی و متعاقباً کاهش یون‌های نقره به فرم نقره متالیک (فلزی) به وسیله فرمالدهید در یک pH بازی عمل می‌کند (Rabilloud et al., 1994).
پس از جدا کردن ژل از دو شیشه الکتروفورز، ژل طبق مراحل زیر رنگ آمیزی گردید:
(نحوه تهیه هر یک از محلول‌های رنگ آمیزی و توضیحات مربوطه در پیوست ۹ می‌باشد.)
۱- در این مرحله هر یک از ژل‌ها در ml100 محلول تثبیت کننده به مدت ۳۰ دقیقه بر روی شیکر با دور آرام (حدود ۵۰rpm) قرار داده شد.
۲- پس از خالی کردن محلول تثبیت کننده، هر ژل در ml 100 محلول حساس کننده قرار داده شد. در این مرحله ژل به مدت ۶۰-۴۰ دقیقه روی شیکر با دور آرام و سپس به صورت over night در محلی به صورت ساکن قرار گرفت. ترکیبات محلول حساس کننده با پروتئین‌ها و ژل واکنش داده تا حساسیت و کنتراست رنگ آمیزی را افزایش دهد (تمامی محلول‌های رنگ آمیزی با آب دوبار تقطیر استریل شده یا آب دیونیزه تهیه گردید).
۳- در این مرحله، پس از دور ریختن محلول دوم، سه مرتبه، و هر مرتبه به مدت ۱۰ دقیقه هر ژل با مقداری آب مقطر دیونیزه شستشو داده شد تا مقادیر اضافی مواد حساس کننده زدوده شدند.
۴- در این مرحله ژل در تاریکی و به مدت ۱۵ دقیقه روی شیکر با دور آرام قرار گرفت. هر ژل در ml 100 محلول رنگ آمیزی نیترات نقره قرار داده شد (یون‌های نقره با پروتئین‌ها و ژل واکنش می دهند).
۵- پس از اتمام زمان رنگ آمیزی، محلول رنگ آمیزی درون ظرف پلاستیکی که به منظور جمع آوری نیترات نقره و رسوب دادن نقره آن به کمک نمک NaCl استفاده گردید، ریخته شد (از ریختن محلول نیترات نقره در فاضلاب شهری جداً اجتناب گردد.)
۶- در این مرحله هر ژل در ml100 محلول آشکار کننده قرار داده شد. این مرحله در حضور نور، روی شیکر با دور آرام تا زمانی که باندهای پروتئینی ظاهر گردیدند انجام گرفت (می‌توان جهت ظهور بهتر در طول مدت آشکار سازی محلول را ۲ الی ۳ بار تعویض نمود). پس از تخلیه محلول آشکار کننده، هر ژل به مدت چند ثانیه با آب مقطر (دیونیزه) شستشو داده شد.
۷- به منظور خاتمه واکنش‌های رنگ آمیزی، پس از ظاهر شدن باندها، هر ژل در ml100 محلول خاتمه دهنده به مدت ۱۵ دقیقه روی شیکر با دور آرام قرار داده شد و پس از آن از ژل‌ها عکس گرفته شد و هر ژل در محلول رقیق اسید استیک ۱۰% نگه‌داری گردید.
پس از این مراحل بررسی تغییرات الگوی پروتئینی و شدت نسبی باندهای پروتئینی در روی ژل‌های به دست آمده توسط نرم افزار ImageJ به صورت کمی انجام گرفت.
۲-۶ جداسازی پروتوپلاست
۲-۶-۱ جداسازی پروتوپلاست
از گیاهان کشت شده در محیط کشت شاهد و تیمار بعد از ۵هفته، مقدار ۱/۰ گرم از برگ ها توزین شد و درون پتری دیش حاوی آب مقطر گذاشته شد تا از پلاسیده شدن آن ها جلوگیری شود. سپس سطح برگ ها با فاصله ی یک میلی متری برش داده شده و درون ۵ میلی لیتر محلول شستشو که حاوی ۵/۷% مانیتول با pH =5.6 (جزئیات در پیوست شماره ۱۰ ) بود به مدت ۱ ساعت قرار داده شد تا سلول های مزوفیل پلاسمولیز شوند. سپس محلول شستشو از پتری دیش خارج شد و به جای آن ۵ میلی لیتر محلول آنزیمی(جزئیات در پیوست شماره ۱۰) که حاوی سلولازR-10 و ماسرووآیزیمR-10 بود ریخته شد. سپس در پتری دیش با پارافیلم کاملاً بسته شد و در محیطی تاریک روی شیکر با مدل basic KS 260 به مدت ۴ ساعت با دور rpm 50 در دمای ۲۸-۲۵ درجه ی سانتی گراد قرار داده شد تا دیواره ی سلولی تجزیه شود. بعد از ۴ ساعت محتویات درون پتری دیش به کمک صافی۵۰ میکرومتری و قیف درون فالکون تیوپ شماره ۱۰ صاف گردید. عصاره ی ایجاد شده با سانتریفوژ مدل eppendorf Centrifuge 5810R به مدت ۵ دقیقه و دور rpm 700 سانتریفوژ شد. سپس مایع رویی را دور ریخته و به جای آن ۱ میلی لیتر محلول شستشو ریخته شد، در ظرف را بسته و فالکون تیوپ را تکان داده تا رسوب ایجاد شده کاملاً درون محلول شستشو حل گردد. برای بار دوم عصاره را سانتریفوژ و با همان دور و زمان قبلی. سانتریفوژ عصاره ۳ بار تکرار شد تا کاملاً از ناخالصی ها پاک شود. بعد از سومین سانتریفوژ و خالی کردن محلول رویی ۱ میلی لیتر محلول شستشو درون فالکون تیوپ ریخته آن را به آرامی تکان داده تا حل شود سپس از این محلول ۲۰ میکرو لیتر برداشته و با کمک لام توما و میکروسکوپ OLYMPUS CH30 شمارش تعداد پروتوپلاست ها انجام شد(Ehsanpour and Jones, 2001).

۲-۶-۲ اندازه گیری قدرت زیست پروتوپلاست
برای اندازه گیری قدرت زیست پروتوپلاست از رنگ فلورسنس دی استات(FDA) استفاده شد. ۱۰ میلی گرم از رنگ FDA در ۱۰ میلی لیتر استون ۱۰۰% حل شد. این محلول باید دوباره رقیق شود و به غلظت۵/۰ میکروگرم در میلی لیتر برسد. برای جلوگیری از آسیب دیدن پروتوپلاست هادر مقابل استون این بار ۱۰ میکرولیتر از رنگ ساخته شده در ۱ میلی لیتر محلول شستشو حل شد، به این ترتیب هر بار که ۵ میکرولیتر از رنگ رقیق شده ی دوم برداشته شود و در ۱ میلی لیتر محلول حاوی پروتوپلاست ریخته شود. غلظت FDA، ۵/۰ به میکروگرم در میلی لیتر می رسد. این بار شمارش پروتوپلاست های زنده با کمک لام و لامل و میکروسکوپHBO 50/AB انجام شد.
۲-۶-۳ بررسی اثر مستقیم نانو نقره بر قدرت زیست پرتوپلاست
به منظور اندازه گیری قدرت زیست پروتوپلاست به طور مستقیم، طبق روشی که در ۲-۶-۲ اشاره شد تنها از گیاهچه هایی که در شرایط کنترل(بدون نانو نقره) بودند پروتوپلاست جداسازی شد. از سویی دیگر محلول های نانو نقره با غلظت های ۵/۰، ۱، ۵/۱ و ۲ میلی گرم در لیتر ساخته شد. سپس این محلول ها با غلظت های مختلف نانو نقره پس از جداسازی پروتوپلاست به فالکون تیوپ حاوی پروتوپلاست ها اضافه شد. همزمان با اضافه شدن نانو نقره به پروتوپلاست ها، رنگ فلورسنس دی استات ۵/۰ میکروگرم در میلی لیتر نیز به آن ها اضافه شد و به سرعت قدرت زیست آن ها با کمک لام و لامل و میکروسکوپHBO 50/AB بررسی شد.

۲-۶-۴ عکس برداری از پروتوپلاست
عکس برداری از پروتوپلاست با کمک میکروسکوپOLYMPUS BX40 انجام شد.
فصل سوم
نتایج
۳-۱ تاثیر نانو نقره بر برخی از شاخص های رشد گیاه سیب زمینی
۳-۱-۱ تاثیر نانو نقره بر وزن تر
نتایج حاصل از اندازه گیری وزن تر گیاه در شکل ۳-۱ ارائه شده است. همانطور که در شکل مشاهده می شود بیشترین وزن تر در غلظت ۰(شاهد) مشاهده شد. در غلظت ۵/۰ ppm نانو نقره این کاهش معنی داد نبود. اما در غلظت های ۱، ۵/۱ و ۲ ppm نانو نقره کاهش معنی داری نسبت به غلظت های ۰ و ۵/۰ ppm نانو نقره مشاهده شد.

شکل۳-۱ اثر غلظت های مختلف نانو نقره بر وزن تر کل گیاه. داده ها میانگین ۳ تکرار± std است. حروف غیر مشابه بیانگر اختلاف معنی دار(P<0.05) بر اساس آزمون توکی است.
۳-۱-۲ تاثیر نانو نقره بر وزن خشک
نتایج آزمایشات نشان داد که بیشترین وزن خشک در غلظت ۰ مشاهده و با افزایش غلظت نانو نقره تا سطح ۲ ppm وزن خشک به ترتیب کاهش یافت. غلظت های ۵/۱ و ۲ ppm نانو نقره کاهش معنی داری را در وزن خشک نسبت به غلظت های ۰ و ۵/۰ ppm نانو نقره نشان دادند. وزن خشک در غلظت های ۵/۰ و ۱ نسبت به شاهد تغییر معنی داری در وزن خشک مشاهده نگردید(شکل ۳-۲).

شکل۳-۲ اثر غلظت های مختلف نانو نقره بر وزن خشک کل گیاه. داده ها میانگین ۳ تکرار± std است. حروف غیر مشابه بیانگر اختلاف معنی دار(P<0.05) بر اساس آزمون توکی است.
۳-۱-۳ تاثیر نانو نقره بر طول ریشه
بررسی ها بر روی اثر نانو نقره بر طول ریشه نشان داد که بیشترین مقدار طول ریشه در محیط کشت فاقد نانو نقره مشاهده شد ولی با افزایش غلظت نانو نقره در محیط کشت این فاکتور به صورت معنی داری کاهش یافت. در غلظت ۵/۰ ppm نانو نقره کاهش طول ریشه در مقایسه با غلظت صفر معنی دار نبود. در غلظت های ۵/۱ و ۲ ppm رشد ریشه به شدت کاهش یافت(شکل ۳-۳).

شکل۳-۳ اثر غلظت های مختلف نانو نقره بر طول ریشه. داده ها میانگین ۳ تکرار± std است. حروف غیر مشابه بیانگر اختلاف معنی دار(P<0.05) بر اساس آزمون توکی است.
۳-۴-۱ تاثیر نانو نقره بر طول ساقه
نتایج نانو نقره بر طول ساقه کم و بیش مشابه با اثر این ماده بر طول ریشه ی گیاه بود. بطوریکه افزایش غلظت نانو نقره موجب کاهش چشمگیر طول ساقه ی گیاه تیمار شده گردید. اختلاف معنی داری بین غلظت های صفر و ۵/۰ ppm نانو نقره مشاهده گردید وهمچنین طول ساقه در غلظت های ۱، ۵/۱ و ۲ کاهش معنی داری نسیت به غلظت های صفر و ۵/۰ نشان داد(شکل ۳-۴).