۱-۶۱-)اتصال Attacment :
پیکورنا ویروسها برای عفونت زایی نیازمند اتصال به غشاء سلول میزبان می باشد تا از این طریق داخل سلول میزبان گردد. این عمل توسط یک سری مولکولهای سطحی غشاء انجام می شود، این مولکولها از سال ۱۹۸۹ با شناخت رسپتورهای سطحی بر علیه پولیوویروس و رینوویروس تشخیص داده شدند (۲۸).

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

در زمینه رسپتورهای پیکورنا ویروس ها سه نکته مهم مشخص گردیده است:
الف) پیکورنا ویروس ها از رسپتورهای متفاوتی برای ورود به سلول استفاده می کنند.
ب) قسمتی از رسپتورها درون سلول قرار دارند مانند رسپتور کوکساکی ویروس B و A و انتروویروس .
ج) در بعضی از پیکورنا ویروس ها وجود یک رسپتور برای عفونت زایی ویروس کافی است ولی در بعضی دیگر نیاز به دو یا چند رسپتور است برای مثال، در کوکساکی ویروس A₂₁ که رسپتور آن CD₅₅ است برای ورود به درون سلول نیاز به ^[۱۲]ICAM-1 دارند (۲۹). بعضی از کوکسا کی ویروس های گروه B علاوه بر رسپتور CD₅₅ از α _V β_۶ Integrinنیز به عنوان کورسپتور جهت اتصال به سلول استفاده می کنند (۴). بر اساس اینکه ویروس از کجا منشاء می گیرد ویروسهای مشخص به رسپتورهای سطحی متفاوتی متصل می شوند به طور مثال FMDV – A12 به اینتگرین α Vβ_۳اتصال می یابد. ولی استرین O- FMDVکه به مدت طولانی در کشت سلولی رشد کرده است نمی تواند به این رسپتور متصل شود و بجایش هپاران سولفات به سطح سلول متصل می شود. استرین FMDV – A12نمی تواند سلولهای راکه فاقد β_۶ Integrin α هستند را آلوده کند حتی اگر هپارین سولفات در سطح سلول باشد. این موضوع نشان می دهد که ویروس خود را در آزمایشگاه سازگار نکرده است و در نبود رسپتور اصلی, خود بتدریج قادر به استفاده از رسپتورهای دیگر شده است (۹).
(جدول ۲) گیرنده ها و کمک گیرنده های مورد استفاده در پیکورنا ویروس.
۱-۶۲-) مکانیسم اتصال به گیرنده های سطح سلولی:
کپسید پیکورنا ویروس از ۴ پروتئین تشکیل شده است که این پروتئین ها بصورت یک ۲۰ وجهی اسمبل می شوند در بین اعضای پیکورنا ویریده، پروتئین های کپسید بطور مشابه ای چیده می شوند (۷و۸).
در سطح کپسید پولیوویروس ها، رینو ویروس ها و کوکساکی ها یک شکاف بنام Canyon می باشد که در اطراف محور تقارن پنج وجهی قرار می گیرد. (شکل۸) ولی در کاردیوویروسها، آفتوویروسها و پاراکوویروسها Canyonوجود ندارد. این محل در پولیوویروس و رینوویروس، بعنوان جایگاهی برای تداخل با گیرنده های سلول می باشد و ایجاد موتاسیون در اسیدهای آمینه این ناحیه تغییراتی در افینیتی اتصال به گیرنده ها ایجاد می کند (۳۰و۳۱).
شکاف پیکورنا ویروس ها باریک و عمیق است و مولکولهای آنتی بادی می توانند به درون آن نفوذ نمایند (۳۱و۳۰).
داروهای ضد ویروسی مانند محصولات win جای لیپید را در کف کینون گرفته و به پاکت اتصال می یابند و مانع از اتصال ویروس به گیرنده های سلولی می شوند. اتصال این دارو به رینوویروس تیپ ۱۴ سبب تغییر شکل کنیون شده و مانع از اتصال به گیرنده های سلولی می شود. ولی اتصال دارو به رینوویروس تیپ های ۱A ، ۳ و ۱۶ و پولیوویروس سبب تغییرات ساختاری کمتری می شود (۳۲).
شکل ۸- تصویر شماتیکی از Canyonنحوه متصل شدن گیرنده ، آنتی بادی به ناحیه Canyon در VP₁
شکل ۹- شکاف Canyonو نحوه قرار گرفتن دارو در VP₁
در FMDV موتاسیون در توالی ) RGDآرژنین-گلایسین-آسپارتیک اسید)سبب ممانعت از اتصال ویروس به گیرنده سلولی می گردد ولی در کوکساکی ویروس۹A توالی RGD در ۱۷ اسید آمینه از انتهای کربوکسیی VP₁واقع شده است و تغییرات در این توالی سبب عدم اتصال به گیرنده سلول نمی شود (۳۴).
ویروس هایی مثل کوکساکی ویروس ۹ Aو FMDV از طریق لوپ های سطحی خود به گیرنده های سلولی متصل می شوند. در FMDVتوالیRGDِ ( آرژنین- گلایسین- آسپارتیک اسید) در لوپ βG-βHاز پروتئین VP₁کپسید قرار دارد و توسط گیرنده هایی از جنس اینتگرین شناسایی می شودو ویروس از طریق این گیرنده ها به سلول ها متصل می گردد (۳۳و۳۴).
۱-۶۳-)ورود به سلول و پوشش برداری ویروس:
پس از اینکه ویروس به گیرنده های سطح سلولی متصل شد باید پوشش برداری^[۱۳] انجام شود و ژنوم ویروس به داخل سیتوپلاسم رها شده و در آنجا تکثیر می گردد که این عمل از طریق کاهش PH و یا فعالیت کمک گیرنده ها صورت می گیرد. به طور مثال در پولیوویروس بعد از اتصال به گیرنده PVr تغییرات اساسی در ساختار ویروس روی می دهد و پارتیکل های A بوجود می آیند و این پارتیکل ها تغییر شکل یافته و پروتئین داخلی VP₄و انتهای آمینی VP₁ را از دست می دهند. ذره A هیدروفوبیک است و بعد از اتصال به ممبران سلولی کانالی را برای عبور ژنوم به درون سیتوپلاسم سلولی ایجاد و RNA ویروس وارد سیتوپلاسم سلولی می شود (۳۶ و ۳۵) .
نظریات متفاوتی درباره مرحله دخول پیکورنا ویروسها وجود دارد یک نظریه بیان می کند که اتصال ویروس به گیرنده باعث تغییرات ساختمانی در ویریون می گردد در این حالت انتهای آمینی VP₁ به طرف بیرون کپسید رانده می شود و در داخل غشاء سلولی نفوذ می کند و ایجاد سوراخ (Pore) در سطح غشاء سلول های آلوده ایجاد شده و RNA ویروس از این راه به درون سیتوپلاسم رها می گردد. (شکل ۵ و ۶) به عنوان مثال FMDVو رینوویروس بعد از اتصال به سلول سبب ایجاد اندوزوم در غشاء سلولی می گردد و توسط اندوسیتوز وارد سلول می شوند که در این ویروس (FMDV) پوشش برداری وابسته به PH است یعنی در PH معادل ۵/۶ کپسید ویروس جدا شده و RNAویروس آزاد می گردد (۳۸و۳۷).
شکل ۱۰)مدل دخول پیکورنا ویروس ها به درون سلول. پارتیکل های ۱۶۰ S به گیرنده های سطح سلول متصل می شوند .در دمای بالای ۳۳ درجه سانتیگراد تغییرات وابسته به گیرنده در آنها روی می دهد که منجر به تولید پارتیکل هایA (تغییر یافته) می شود . این ذرات هیدروفوب بوده , VP4 و انتهای آمینی از VP1 را از دست داده اند. مرحله Uncoating به دو طریق (غشای پلاسمایی یا غشای اندوزوم ها) صورت می کیرد و RNA ی ویروسی به درون سیتوپلاسم رها می گردد.
شکل ۱۱)ممکانیسم فرضی برای عبور RNA ی پیکورنا ویروسها از عرض غشا. (سمت چپ) اتصال ویروس به گیرنده را نشان می دهد. RNA در داخل کپسید قرار دارد و لیپید ها نیز درون پاکت هیدروفوب را می پوشاند. گیرنده نیز به کانیون (در بالای پاکت) متصل می شود .(سمت راست) تغیرات ساختمانی در کپسید روی می دهد. حرکت گیرنده در کانیون باعث خروج لیپید از پاکت می گردد و اجازه می دهد که تغییرات ساختاری در کپسید روی دهد. انتهای آمینی VP1 کشیده می شود و در داخل غشای سلولی منفذی ایجاد می کند که RNA از طریق آن به درون سیتوپلاسم رها می گردد.
۱-۷) ترجمه ژنوم پیکورنا ویروسها :
وقتی ژنوم +SSRNA ویروس به درون سیتوپلاسم سلول میزبان رها می گردد لازم است که به پروتئین های غیر ساختمانی (nsp) و پروتئین های ساختمانی (sp) ترجمه گردد (۳۹). در درون ویریون پیکورنا ویروسها همانند ویروسهای پلارتیه مثبتRNA polymerase RNA dependent وجود ندارد از طرف دیگر RNApolymerase سلولی نیز قادر به رونویسی از ژنهای این ویروس نمی باشد. در ابتدای۵´ ژنوم پیکورنا ویروسها کلاهک ۵´-cap وجود ندارد ولی دارای یک پروتئین کوچک به نام Vpgاست که بعد از ورود ژنوم به سلول میزبان توسط آنزیم سلولی Unlinking Enzyme برداشته می شود (۳۹). تعیین توالی ژنوم پیکورنا ویروسها نشان داد که ۷۴۱ نوکلئوتید در ابتدای ناحیه ژنوم ۵´ وجود دارد این ناحیه را ۵´- UTR نامیدند در این ناحیه توالی های IRES، بخش غنی از بازهای پریمیدنی و کدون شروع ترجمه AUG قرار دارد (۴۱و۴۰).
با اتصال زیر واحد ۴۰_S ریبوزوم به IRES ترجمه آغاز می گردد و بلافاصله ^[۱۴]elf₃ به انتهای کربوکسیلی elF4G اتصال می یابد و ترجمه شروع می گردد. البته این عمل توسط پروتئین ۲Aتقویت می گردد پس برای شروع ترجمه نیاز به قسمتی از elF4Gکه توسط ۲A فراهم شده, می باشد. (هپاتوویروسها نیاز به elF4Gبه صورت کامل دارند.) (۴۲).
۱-۱-۷)اتو آنتی ژن La :
پروتئین سلولی است که در بلوغ RNA polymerase III نقش دارند و سبب فعالیت IRES در پولیوویروس می شود. این اتو آنتی ژن برای فعالیت IRESدر EMCV لازم است (۴۵و۴۴).
۱-۲-۷)پروتئین متصل شونده به پلی پیریمیدین (PTB) :
در تنظیم Splicing (بازآرایی) mRNAنقش دارد و حذف آن مانع از فعالیت IRES در EMCVمی شود (۴۳).
۱-۸) پردازش پلی پروتئین در پیکورنا ویروسها:
با انجام فرایند ترجمه یک پیش ساز پلی پروتئین تولید می شود که توسط پروتئازهای ویروسی شکسته می شود. پیکورنا ویروس ها سه پروتئاز را کد می کنند که شامل L^pro, 2A^pro, 3C^pro می باشد و معمولاً اولین کلیواژ در ابتدای این پروتئازها روی می دهد و با آزاد شدن آنها بقیه پلی پپتیدها شکسته می شوند (۱۶و۸و۷).
۱-۸-۱) پروتئین L :
در آفتو ویروس اولین کلیواژ در پروتئین L انجام می شود. این پروتئین سبب برش در انتهای کربوکسی خودش و انتهای آمین VP₄ می گردد و با این کار از ابتدای پلی پروتئین رها می شود و بعد از آن با شکستن elF4Gاز ترجمه ماکرو مولکولهای سلولی جلوگیری می کند (۴۶و۴۷).
در کاردیو ویروسها پروتئین L فعالیت پروتئولیتیکی ندارد.
۱-۸-۲) پروتئین ۲A :
در کاردیو ویروس پروتئین ۲A ، ۱۵۰ اسید آمینه طول دارد و ۱۹ اسید آمینه آخری به اضافه اولین اسید آمینه از پروتئین ۲B (برولین) برای جدایی از پروتئین ۲B لازم است (۵۰). در سلولهای آلوده به انترو ویروسها و رینو ویروسها اولین کلیواژ توسط ۲A^proو در محل اتصال P1/P2 روی می دهد. محل اثر پروتئین ۲A بین دو اسید آمینه تیروزین و گلیسین می باشد ولی در بعضی از کوکساکی و اکوویروسها هم محل اثر ۲A بین ترئونین و گلایسین و یا بین آلانین و گلایسین می باشد. ۲A^pro مانند پروتئیناز A در باکتری استرپتومایسس گریوس می باشد (۴۸).(شکل ۱۲)
در بین پیکورنا ویروسها، تنها دو جنس هپاتوویروسها و پاراکوویروس هستند که ۲A^proدر آنها فعالیت پروتئولیتیکی ندارد (۴۹). ۲A^pro برای عملکرد نیازمند به یون روی (ZN) است.
۱-۸-۳) پروتئین ۳C :
تمام پیکورنا ویروسها ۳C^pro را کد می کنند و عملکرد آن ایجاد شکست ما بین ۲C/3A می باشد البته استثناهایی هم وجود دارد مثلاً در هپاتو ویروس سبب برش بین ۲A/2B نیز می شود. در پولیو ویروس این پروتئین سبب برش در ناحیه دی پپتیدی Gly- Gly می شود ولی در بقیه پیکورنا ویروسها عمل برش در مناطق Gln-Ala- Gln- ser , Gln- Ile,Gln,Asn, Gln-Thr, Gln, Val انجام می گیرد (۸).
با تعیین توالی اسیدهای آمینه ۳C ^pro مشخص گردید که مشابه سرین پروتئینازهای شبیه کیموتریپسین می باشد (شکل ۸). ۳C ^proحاوی ۲ مکان فعال است که یک قسمت به RNAمتصل می گردد و قسمت دیگر مسئول اعمال پروتئولیتیکی می باشد (۵۱).
۳C ^pro و ۲A ^pro با عمل اتوکاتالیتیکی خود موجب آزاد شد نشان از رشته پلی پروتئینی می شوند و بعد از جدا شدن سبب شکسته شدن پلی پروتئین به صورت ترانس می شود و به صورت آبشاری پپتیدها را کلیواژ می کنند.در سلول های آلوده با رینوویروسها و انترو ویروسها، ابتدا با عمل پروتئازی ۲A ^pro ناحیه p1/ p2 – p3 کلیواژ می گردد سپس ۳CD ^pro خودش را می شکند و از قسمت P3 جدا می شود و سپس P1 /P2 را کلیواژ می کند (۵۱).
شکل۱۲) : تصویر سه بعدی از ۳C ^pro ویروس هپاتیت A ، ۲A ^pro رینو ویروس و FMDV L ^pro ، در پائین هم پروتئازهای سلولی مشابه با هر کدام آمده است
۱-۹) تکثیر ژنوم و سنتز :mRNA
تا سال ۱۹۵۰ بر این اعتقاد بودند که سنتز RNA ویروس توسط RNA پلی مر از وابسته به DNA است که تکثیر ویروس هم در داخل هسته انجام می گیرد. در اوایل سال ۱۹۶۰ بود که یک مطالعه روی مننگو ویروس انجام گرفت و مشاهده کردند که اگر اکتینو مایسن D ( یک داروی متوقف کننده سنتز RNA در هسته) به سلول های آلوده به ویروس اضافه شود قادر نیست که از تکثیر ویروس جلوگیری نماید و از این موضوع نتیجه گرفتند که برای تکثیر ویروس آنزیم RNA پلی مراز باید در سیتوپلاسم وجود داشته باشد که یک آنزیم RNAپلیمراز وابسته به RNA است (۵۲).
در سلول های آلوده پولیو سه شکل از ژنوم را می توانیم مشاهده می کینم:
۱-+SSRNA ( RNAتک رشته ای با پولاریته مثبت)
۲- RI( حد واسط تکثیری با پولاریته منفی Replication intermediate )
۳- RF ( شکل تکثیری با پولاریته مثبت Replication form ) (53).
سنتز RNAویروسی بصورت نامتقارن (Asymmetric)است بدین صورت که زنجیره مثبت ۲۵ تا ۶۵ برابر بیشتر از زنجیره منفی سنتز می گردد (۵۴).
۱-۹-۱) RNAپلیمر از وابسته به RNA ویروسها (۳D ^pol) :
در بررسی از غشاء سلولی به مجموعه ای از غشاء سلولی برخوردند که در امر سنتزدخا لت داشتند و به نام کمپلکس تکثیر RNA^[15] نامیده شد. یکی از مهمترین اجزاء این کمپلکس یک پروتئین kd63 به نام RNAپلی مراز وابسته به RNA ویروس بود علاوه بر این تعداد دیگری از پروتئین های ویروسی و سلولی نیز در این کمپلکس حضور داشتند مانند ۳Cو ۲BC, 2C, 3ABکه پروتئین ۳Dمهمترین پروتئین کمپلکس تکثیر بود (۵۵).