زمان

تکرار

زمان

تکرار

Initial denaturation

95

5 دقیقه

1 سیکل

Denaturation

95

45 ثانیه

30سیکل

Annealing

60

45 ثانیه

Extension

72

45 ثانیه

Final extension

72

10 دقیقه

1 سیکل

3-8-6-روش تهیه­ ژل آگارز و انجام الکتروفورز
به منظور بررسی صحت قطعات محصولات PCR، از روش الکتروفورز محصولات بر روی ژل آگارز استفاده گردید.
برای ساخت ژل 7/1% آگارز،93/0 گرم پودر آگارز در 55 میلی­لیتر بافرTAE 1x ^[66] در ارلن حل شد و به خوبی در مایکروویو حرارت داده شد تا محلولی کاملاً شفاف به دست آید. محلول ژلی تهیه شده در سینی ژل که دارای شانه مناسب بوده، ریخته شد و به مدت 20 تا 30 دقیقه به حالت سکون قرار داده شد تا ژل کاملاً بسته شود. سپس با احتیاط به گونه ­ای که چاهک­های ژل آسیب نبیند، شانه از ژل خارج گردید. سپس به همه نمونه­ها به میزان 2 میکرولیتر مایع رنگ­کننده­ Loading Dye افزوده شد. بعد از قرار گیری ژل در تانک پر از بافر TAE، 10 میکرولیتر از هر نمونه و 1 میکرولیتر Ladder به چاهک­ها افزوده و دستگاه الکتروفورز بر روی ولتاژV 95 قرار داده شد، پس از گذشت حدوداً 45 دقیقه، ژل به مدت 15 الی 20 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده و نهایتاً پس از شستشو با آب مقطر درون دستگاه ثبت ژل گذاشته شد. عکس مورد نظر در کامپیوتر مشاهده و نهایتاً تصویر ژل ذخیره شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

3-8-7- طرز تهیه­ محلول­ها
1- بافر50x TAE
در ابتدا، میزان 242گرم پودر Tris-Base در 500 میلی لیتر آب دیونیزه حل شد. سپس 100 میلی لیتر محلول EDTA 0.5M با PH=8 و پس از آن 57/1 میلی لیتر اسیداستیک اشباع شده به آن افزوده شد. در نهایت حجم محلول با آب دیونیزه به 1000میلی لیتر رسید و در دمای اتاق نگهداری شد.
2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml)
لازم به ذکر است که اتیدیوم بروماید ترکیبی بسیار خطرناک و سرطان­زا می­باشد، لذا در هنگام کار با اتیدیوم بروماید رعایت اصول ایمنی ضروری است. به سبب خاصیت فلورسانس اتیدیوم این ماده و ترکیب آن با بازهای داخل مولکول­های DNA، شدت نور حاصله از اینترکاله شدن اتیدیوم بروماید، باندها قابل رویت و توسط دستگاه ثبت ژلذخیره می­شوند. جهت تهیه­ محلول اتیدیوم بروماید به ازای هر لیتر آب مقطر، 50 میکرولیتر اتیدیوم بروماید به آن اضافه گردید.
3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش واکنش زنجیره­ای پلیمرازپیوسته^[67]
برای بررسی و مقایسه­ میزان بیان ژن Kdm5d در نمونه­های بافت بیضه­ی موش­های بالغ، از واکنش زنجیره­ای پلیمراز پیوسته استفاده شد. در روش RT-PCR، بررسی بیان ژن به صورت کیفی انجام شد و حضور یا عدم حضور باندها و تا حدی شدت باندها نشان دهنده تغییرات بیان ژن بود. اما با روش Real-Time PCR، بررسی این تغییرات به صورت کمی انجام شد. در سال 1996 شرکت ABI تکنيک Real-time PCR را به صورت تجاري معرفي کرد و تا به امروز اين روش کمي، صحيح­ترين و حساس­ترين روش براي آشکارسازي و کمي­سازي اسيدهاي نوکلئيک به شمار مي­رود. اختصاصي بودن و حساسيت بالاي آن همراه با آشکارسازي مستقيم قطعات هدف، با بهره گرفتن از پرايمرها و پروب­هاي نشاندار شده با مواد فلورسنت و يا رنگ­هاي فلورسنت، مشکلاتي از قبيل ژل الکتروفورز، انتقال به غشا، دورگه­سازي^[68] پروب­هاي راديواکتيو و محدوديت­هاي فيلم به عنوان آشکارساز را برطرف ساخت.
Real-time PCR از مولکول­هاي گزارشگر فلورسنت براي نمايش محصولات تکثير شده در طول هر سيکل واکنش PCR استفاده مي­کند. اين تکنيک امکان آشکارسازي محصول PCR در طول فاز لگاريتمي واکنش و همچنين ترکيب مرحله تکثير و آشکارسازي در يک مرحله را فراهم ساخته و نيازي به بررسي پس از PCR، مانند ژل الکتروفورز نيست. مقدار فلورسانس منتشر شده مستقيما به مقدار محصول توليد شده در هر سيکل PCR نسبت داده مي­شود، بنابراين مي­تواند به عنوان يک سنجش کمي از واکنش PCR به کار رود. محصولات PCR را مي­توان با بهره گرفتن از رنگ­هاي فلورسانس که به DNA دو رشته­اي متصل مي­شوند، يا با بهره گرفتن از پروب­هاي نشان­دار شده با مواد فلورسانس ويژه، مورد سنجش قرار داد.
3-8-8-1-روش C_t مقايسه­اي براي کمي­سازي نسبي
در اين روش، به جاي منحني استاندارد از يک فرمول رياضي استفاده مي­شود. مقدار هدف نرمال شده نسبت به يک کنترل دروني و نسبت به يک کاليبراتور با بهره گرفتن از فرمول زير محاسبه مي­شود: 2^-ΔΔCt
هنگام استفاده از اين متد، مي­توان با کمک داده­هاي حاصل در طول آزمايش PCR، يعني مقادير C_t، آنها را مستقيما نسبت به يک مرجع دروني نرمال کرد و ديگر نيازي به تهيه منحني استاندارد براي ژن هدف و کنترل دروني در تمام نمونه­هاي آزمايشي نيست. اين موضوع زماني مفيد است که يک مقدار محدود از RNA در اختيار دارد يا زماني که مي­خواهد پردازش گسترده­اي از تعداد زيادي نمونه انجام دهد.
به منظور ارزيابي کمّی بيان رونوشت Kdm5d، تکنيک Real-time -PCR با بهره گرفتن از دستگاه Applied Biosystems 7500 و پرايمر Gapdh به عنوان کنترل داخلي مورد استفاده قرار‌گرفت.مواد لازم و چرخه­هاي دمايي به ترتيب در جدول (3-9) و (3-10) ذکر شده ‌است. لازم بذکر است که cDNA ساخته شده در مرحله 2-8-3 مورد استفاده قرارگرفت.
روش کار:
برای انجام Real Time-PCR، از پرایمر طراحی شده­ برای ژن Kdm5d و از پرایمر Gapdh به عنوان Housekeeping Gene استفاده شد. از cDNA­های سنتز شده از RNA مربوط به نمونه­های بافتی، به عنوان الگو در این واکنش استفاده شد. در این روش مواد یاد شده در جدول 3-5، به ازای هر واکنش داخل استریپ­های مخصوص Real-Time PCR ریخته شد. لازم به ذکر است که پس از افزودن ماده­ فلورسنت SYBR، ادامه کار در تاریکی انجام شد، زیرا این ماده در اثر برخورد با نور غیر فعال می­ شود و هم چنین تمام مراحل کار روی یخ انجام پذیرفت. پس از اتمام کار، استریپ­های حاوی نمونه به داخل دستگاهApplie Biosystem-7000 System ،Step One Plus System منتقل و پس از تنظیم برنامه دمایی ذکر شده در جدول 3-10، Real-Time PCR آغاز شد. اعداد نمایش داده شده در پایان کار به جای باندهای روی ژل، در روش RT-PCR تغییرات بیان ژن را نشان می دهد.
جدول(3-9): اجزاي لازم براي انجام واكنش Real-Time PCR

Initial denaturation

95

5 دقیقه

1 سیکل

Denaturation

95

45 ثانیه

30سیکل

Annealing

60

45 ثانیه

Extension

72

45 ثانیه

Final extension

72

10 دقیقه

1 سیکل

3-8-6-روش تهیه­ ژل آگارز و انجام الکتروفورز
به منظور بررسی صحت قطعات محصولات PCR، از روش الکتروفورز محصولات بر روی ژل آگارز استفاده گردید.
برای ساخت ژل 7/1% آگارز،93/0 گرم پودر آگارز در 55 میلی­لیتر بافرTAE 1x ^[66] در ارلن حل شد و به خوبی در مایکروویو حرارت داده شد تا محلولی کاملاً شفاف به دست آید. محلول ژلی تهیه شده در سینی ژل که دارای شانه مناسب بوده، ریخته شد و به مدت 20 تا 30 دقیقه به حالت سکون قرار داده شد تا ژل کاملاً بسته شود. سپس با احتیاط به گونه ­ای که چاهک­های ژل آسیب نبیند، شانه از ژل خارج گردید. سپس به همه نمونه­ها به میزان 2 میکرولیتر مایع رنگ­کننده­ Loading Dye افزوده شد. بعد از قرار گیری ژل در تانک پر از بافر TAE، 10 میکرولیتر از هر نمونه و 1 میکرولیتر Ladder به چاهک­ها افزوده و دستگاه الکتروفورز بر روی ولتاژV 95 قرار داده شد، پس از گذشت حدوداً 45 دقیقه، ژل به مدت 15 الی 20 دقیقه در محلول اتیدیوم بروماید قرار داده و نهایتاً پس از شستشو با آب مقطر درون دستگاه ثبت ژل گذاشته شد. عکس مورد نظر در کامپیوتر مشاهده و نهایتاً تصویر ژل ذخیره شد.
3-8-7- طرز تهیه­ محلول­ها
1- بافر50x TAE
در ابتدا، میزان 242گرم پودر Tris-Base در 500 میلی لیتر آب دیونیزه حل شد. سپس 100 میلی لیتر محلول EDTA 0.5M با PH=8 و پس از آن 57/1 میلی لیتر اسیداستیک اشباع شده به آن افزوده شد. در نهایت حجم محلول با آب دیونیزه به 1000میلی لیتر رسید و در دمای اتاق نگهداری شد.
2- محلول رنگ آمیزی اتیدیوم برماید (10mg/ml)
لازم به ذکر است که اتیدیوم بروماید ترکیبی بسیار خطرناک و سرطان­زا می­باشد، لذا در هنگام کار با اتیدیوم بروماید رعایت اصول ایمنی ضروری است. به سبب خاصیت فلورسانس اتیدیوم این ماده و ترکیب آن با بازهای داخل مولکول­های DNA، شدت نور حاصله از اینترکاله شدن اتیدیوم بروماید، باندها قابل رویت و توسط دستگاه ثبت ژلذخیره می­شوند. جهت تهیه­ محلول اتیدیوم بروماید به ازای هر لیتر آب مقطر، 50 میکرولیتر اتیدیوم بروماید به آن اضافه گردید.
3-8-8- بررسی کمی بیان ژن با بهره گرفتن از روش واکنش زنجیره­ای پلیمرازپیوسته^[67]
برای بررسی و مقایسه­ میزان بیان ژن Kdm5d در نمونه­های بافت بیضه­ی موش­های بالغ، از واکنش زنجیره­ای پلیمراز پیوسته استفاده شد. در روش RT-PCR، بررسی بیان ژن به صورت کیفی انجام شد و حضور یا عدم حضور باندها و تا حدی شدت باندها نشان دهنده تغییرات بیان ژن بود. اما با روش Real-Time PCR، بررسی این تغییرات به صورت کمی انجام شد. در سال 1996 شرکت ABI تکنيک Real-time PCR را به صورت تجاري معرفي کرد و تا به امروز اين روش کمي، صحيح­ترين و حساس­ترين روش براي آشکارسازي و کمي­سازي اسيدهاي نوکلئيک به شمار مي­رود. اختصاصي بودن و حساسيت بالاي آن همراه با آشکارسازي مستقيم قطعات هدف، با بهره گرفتن از پرايمرها و پروب­هاي نشاندار شده با مواد فلورسنت و يا رنگ­هاي فلورسنت، مشکلاتي از قبيل ژل الکتروفورز، انتقال به غشا، دورگه­سازي^[68] پروب­هاي راديواکتيو و محدوديت­هاي فيلم به عنوان آشکارساز را برطرف ساخت.
Real-time PCR از مولکول­هاي گزارشگر فلورسنت براي نمايش محصولات تکثير شده در طول هر سيکل واکنش PCR استفاده مي­کند. اين تکنيک امکان آشکارسازي محصول PCR در طول فاز لگاريتمي واکنش و همچنين ترکيب مرحله تکثير و آشکارسازي در يک مرحله را فراهم ساخته و نيازي به بررسي پس از PCR، مانند ژل الکتروفورز نيست. مقدار فلورسانس منتشر شده مستقيما به مقدار محصول توليد شده در هر سيکل PCR نسبت داده مي­شود، بنابراين مي­تواند به عنوان يک سنجش کمي از واکنش PCR به کار رود. محصولات PCR را مي­توان با بهره گرفتن از رنگ­هاي فلورسانس که به DNA دو رشته­اي متصل مي­شوند، يا با بهره گرفتن از پروب­هاي نشان­دار شده با مواد فلورسانس ويژه، مورد سنجش قرار داد.
3-8-8-1-روش C_t مقايسه­اي براي کمي­سازي نسبي
در اين روش، به جاي منحني استاندارد از يک فرمول رياضي استفاده مي­شود. مقدار هدف نرمال شده نسبت به يک کنترل دروني و نسبت به يک کاليبراتور با بهره گرفتن از فرمول زير محاسبه مي­شود: 2^-ΔΔCt
هنگام استفاده از اين متد، مي­توان با کمک داده­هاي حاصل در طول آزمايش PCR، يعني مقادير C_t، آنها را مستقيما نسبت به يک مرجع دروني نرمال کرد و ديگر نيازي به تهيه منحني استاندارد براي ژن هدف و کنترل دروني در تمام نمونه­هاي آزمايشي نيست. اين موضوع زماني مفيد است که يک مقدار محدود از RNA در اختيار دارد يا زماني که مي­خواهد پردازش گسترده­اي از تعداد زيادي نمونه انجام دهد.
به منظور ارزيابي کمّی بيان رونوشت Kdm5d، تکنيک Real-time -PCR با بهره گرفتن از دستگاه Applied Biosystems 7500 و پرايمر Gapdh به عنوان کنترل داخلي مورد استفاده قرار‌گرفت.مواد لازم و چرخه­هاي دمايي به ترتيب در جدول (3-9) و (3-10) ذکر شده ‌است. لازم بذکر است که cDNA ساخته شده در مرحله 2-8-3 مورد استفاده قرارگرفت.
روش کار:
برای انجام Real Time-PCR، از پرایمر طراحی شده­ برای ژن Kdm5d و از پرایمر Gapdh به عنوان Housekeeping Gene استفاده شد. از cDNA­های سنتز شده از RNA مربوط به نمونه­های بافتی، به عنوان الگو در این واکنش استفاده شد. در این روش مواد یاد شده در جدول 3-5، به ازای هر واکنش داخل استریپ­های مخصوص Real-Time PCR ریخته شد. لازم به ذکر است که پس از افزودن ماده­ فلورسنت SYBR، ادامه کار در تاریکی انجام شد، زیرا این ماده در اثر برخورد با نور غیر فعال می­ شود و هم چنین تمام مراحل کار روی یخ انجام پذیرفت. پس از اتمام کار، استریپ­های حاوی نمونه به داخل دستگاهApplie Biosystem-7000 System ،Step One Plus System منتقل و پس از تنظیم برنامه دمایی ذکر شده در جدول 3-10، Real-Time PCR آغاز شد. اعداد نمایش داده شده در پایان کار به جای باندهای روی ژل، در روش RT-PCR تغییرات بیان ژن را نشان می دهد.
جدول(3-9): اجزاي لازم براي انجام واكنش Real-Time PCR