ب

ج
شکل ۱-۵- مکانیسم­های دفاعی گیاه که آنتی اکسیدان­های اسکوربات و گلوتاتیون در آنها ایفای نقش می­نماید
الف) چرخه مهلر Asada, 2000))، ب) چرخه گلوتاتیون- اسکوربات (Edreva, 2005) و ج) چرخه گزانتوفیل (.(Jiang et al., ۲۰۰۶
و گندم که در معرض تنش خشکی قرار گرفته­اند نشان می­دهد که همزمان با تولید H₂O₂این افزایش می ­تواند منجر به جذب الکترون­های فردوکسین توسط NADP گردد که در نتیجه میزان تولید سوپراکسید کاهش می­یابد .(Smirnoff, 1998) افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز در اثر خشکی و یا درجه حرارت بالا توسط سایر محققین نیز گزارش شده است Asada, 1999)).
به­ طور­کلی تنش­های محیطی تولید سوپراکسید را افزایش می­ دهند. این تولید می تواند برای انسجام و عملکرد غشا مهلک باشد زیرا عکس­العمل­های متفاوت بین پروتئین­ها و لیپیدها ممکن است جایگاه گونه­ های مولکولی متنوع را در لیپید دولایه به طوری تغییر دهد که آنها بیشتر در معرض اکسیژن قرار گیرند، بنابراین تولید رادیکال پروکسید افزایش می­یابد (Takahashi et al., 1987). تولید رادیکال­های اکسیژن آزاد، مسئول پراکسیداسیون لیپیدهای غشا وابسته به تنش هستند که منجر به صدمه غشا و بی­رنگ شدن رنگیزه­ها می­گردد (Sairam and Saxen, 2000). پراکسیداسیون لیپیدی شامل کاهش سیالیت غشاء، تسهیل تبادل بین دو لایه فسفولیپیدی، افزایش تراوایی غشاء به مواد که بطور معمول از آن عبور نمی­کنند، آسیب دیدگی پروتئین­های غشائی، غیر فعال شدن گیرنده­ها، آنزیم­ها و کانال­های یونی می­باشد (Singh and Tuteja, 2010). مالون­دی­آلدهید (^[۲۲]MDA)، محصول تجزیه اسیدهای چرب پلی-غیر اشباع است که به عنوان مارکر زیستی پراکسید­اسیون چربی بکار گرفته می­ شود (Shakirova, 2007). بررسی غلظت مالون­دی­آلدهید بافت گیاهی می ­تواند بیانگر میزان تخریب غشا سلولی باشد زیرا این ترکیب تحت تأثیر تخریب و پراکسیده شدن غشا سلولی آزاد می­ شود (Bhattacharjee and Mukherjee, 2002) .بنابراین پایداری غشای سلول بطور گسترده بکار گرفته می­ شود تا واریته­های حساس و مقاوم را از هم متمایز نماید. برگهایی از گیاه گوجه­ فرنگی که تحت تنش خشکی قرار گرفتند، افزایش در پراکسیداسیون لیپیدی را نشان دادند Nasibi, 2011)).

( اینجا فقط تکه ای از متن پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۱-۲-۵ ﺗﺄثیرتنش خشکی بر میزان نیترات و نیترات ردوکتاز
یکی از عوامل کاهش کارکرد در شرایط کمبود آب را می­توان به کاهش دسترسی گیاه به نیتروژن نسبت داد
.(Boutraa and Sanders, 2001) اگر چه خشکی بسیاری از جنبه­ های گیاه را تحت تأثیر قرار می­دهد، اما حساسیت تثبیت نیتروژن به کمبود آب بیشتر است، زیرا بسیاری از فرآیندهای زیست شیمیایی گیاه تا تخلیه ۷۰ الی ۸۰ درصد رطوبت قابل استفاده خاک تحت تأثیر قرار نمی­گیرند، در حالی که تخلیه ۵۰ درصد از رطوبت قابل استفاده خاک موجب کاهش تثبیت نیتروژن می­گرددSerraj, 2003) ). افزایش تنش آبی باعث کاهش فراوانی تارهای کشنده، فراوانی باکتری، قدرت چسبندگی و نفوذ باکتری به تارهای کشنده، انتشار اکسیژن از سطح گره به داخل و کاهش فعالیت آنزیمی شده و در نتیجه بر تثبیت نیتروژن و رشد گیاه پیامد منفی دارد .(Serraj, 2003) در مورد علت کاهش تثبیت نیتروژن در اثر تنش آبی نظرات متفاوتی وجود دارد. برخی علت آن را کاهش فتوسنتز و ساخت کربوهیدرات­ها، کاهش فراوانی گره­های ریشه و یا کاهش انتقال دهنده­های اکسیژن در گره می­دانند، که سبب انباشتگی اکسیژن در گره­ها و بدنبال آن کاهش فعالیت آنزیم نیتروژناز می شودGordon et al., ۱۹۹۷) ). گیاهان هنگام تنش خشکی با ساز­ و ­کارهای ویژه­ای شرایط خشکی را بردباری می­ کنند، با این حال کاهش رشد در آنها دیده می­ شود. یکی از دلایل کاهش رشد، کاهش جذب عناصر غذایی به ویژه نیتروژن و فسفر است (Boutraa and Sanders, 2001) و گیاهانی که دارای مقادیر کافی نیتروژن و فسفر باشند بردباری بیشتری در برابر تنش آبی نشان می­ دهند .(Misra and Tyler, 1999) یکی از راه­های تأمین نیتروژن تثبیت زیستی است و در شرایطی که نیتروژن به اندازه کافی در دسترس گیاه قرار گیرد جذب فسفر و سایر عناصر غذایی افزایش می­یابد .(Watson et al., (1988 تنش اسمزی موجب بسته­شدن روزنه­ها شده که می ­تواند عامل اصلی در کاهش حصول CO₂ در گیاه تلقی گردد. با محدود­شدن تامین کربوهیدرات ریشه، این اندام فعالیتش کاهش یافته و بر همین اساس جذب مواد غذایی مخصوصا” نیتروژن کاهش می­یابد. کاهش نیتروژن نیز با کاهش پروتئین­ها ارتباط مثبتی دارد. از آنجایی که گیاهان بطور گسترده­ای در نیازهای غذایی و در توانایی­شان در جذب مواد غذایی ویژه متفاوت­اند، بنابراین ﺗﺄثیر تنش­های خشکی و شوری نیز می ­تواند در بین گونه­ های مختلف متفاوت باشد. در بین بسیاری از مواد مغذی مورد نیاز رشد و گسترش سلول­های گیاهی، نیتروژن نقش اساسی در توانایی گیاهان در تحمل به تنش شوری و خشکی ایفا می­نماید (Botella et al., ۱۹۹۳). شوری می ­تواند موجب تنش اسمزی و سمیت مخصوص شوری گشته که به­واسطه تجمع بیش از حد نمک در بافت گیاهی بوده و شامل ﺗﺄثیرات ثانویه شدید بر روی پارامترهای متابولیسم نیتروژن نظیر جذب نیتروژن و فعالیت نیترات ردوکتاز می­باشد. نیترات ردوکتاز یک عامل محدود­­کننده رشد و نمو و تولید پروتئین در گیاهان است، چرا که فعالیتش مستقیماً تغییر یافته و روی رشد گیاه ﺗﺄثیر می­ گذارد (Zornoza and Gonzales, 1998). مشخص شده است که میزان جذب نیتروژن در گیاهان با غلظت بالای شوری NaCl کاهش می­یابد (Huang et al., ۱۹۹۳). کاهش در جذب یون مخصوصا NO₃^-در غشای پلاسمایی و سطوح تونوپلاست، شاید به­علت مکانیسم­های رقابتی و یا تغییر در غشا باشد (Luttge, 1993).
یکى از آنزیم­هایى که نقش کلیدى در سلسله فرایند­­هاى مربوط به مصرف نیترات دارد، نیترات ردوکتاز است. شواهد زیادى حاکى از پیچیدگى تنظیم این آنزیم وجود دارد .(Werner et al., ۱۹۹۵; Huber and Huber, 1995) همچنین پژوهش­هاى متعددى دال بر پاسخ­هاى متفاوت این آنزیم همراه با تغییر شرایط محیطى موجود است(Werner et al., Huber et al., ۱۹۹۸; ۱۹۹۵). براى نمونه فعالیت این آنزیم در برگ به تغییرات وضعیت آبى حساس بوده و زمانى­که پتانسیل آبى کاهش مى­یابد فعالیت آنزیم نیز مهار مى­شود.(Christine et al., ۱۹۹۸) به نظر برخى از محققان این کاهش ناشى از میزان سنتز این آنزیم است که این عامل مهم­تر از کاهش فعالیت آنزیم در این شرایط است. پژوهش­هایى که در زمینه سویا صورت گرفته است نشان مى­دهد که تحت شرایط خشکى نیترات به مقدار زیاد در ریشه­ها تجمع مى­یابد و مى­تواند منبع با ارزشى براى سنتز اسید­هاى آمینه تحت شرایط شورى در نظر گرفته شود Hissao, 1973)). گزارش شده است که آنزیم نیترات ردوکتاز حساس به تغییرات وضعیت رطوبت برگ بوده و با کاهش شدید پتانسل آبى فعالیت آن در این بخش از گیاه مهار مى­شود .(Tejo and Diaz, 1987)همچنین گزارش شده است که در طى خشکى فعالیت آنزیم نیترات ردوکتاز در اندام هوایى بیش از ریشه کاهش مى­یابد که این امر به کاهش جریان نیترات از ریشه به اندام هوایى نسبت داده شده است .(Heuer et al., ۱۹۷۹) گزارش کرده ­اند که در گیاه سویا در زمان کم آبى، نیترات به مقدار زیاد تجمع مى­یابد که مى­تواند به عنوان منبع نیتروژن براى سنتز اسید­هاى­ آمینه آزاد مورد استفاده قرار گیرد(Silva, 2004) .
۱-۲-۶ ﺗﺄثیر تنش خشکی بر القای اسمولیت­های سازگار
در چرخه­ زندگی، گیاهان تحت تأثیر انواع گوناگونی از تنش­های محیطی قرار می­گیرند که برای زنده ماندن مجبور به یکسری تغییرات در فعالیت­های زیست شیمیایی و آنزیمی می­شوند. پاسخ گیاهان به کمبود آب بسیار پیچیده است و می ­تواند شامل اثرات مخرب و یا تغییرات سازشی باشد. پاسخ اولیه به کمبود آب در زنده ماندن گیاه در شرایط دشوار لازم و ضروری است .(Chaves, 2002) تنظیم اسمزی به عنوان یکی از مکانیسم­های اصلی گیاه برای بردباری در برابر تنش خشکی در نظر گرفته شده است. زمانی که یاخته در تنش اسمزی پایین قرار می­گیرد، اسمولیت­ها یا متابولیت­های سازگار در آن انباشته می­شوند .(Serraj and Sinclair, 2002) نوع متابولیت­های سازگار در گونه­ ها و ارقام گوناگون گیاهی ناهمانند است، این متابولیت­های سازگار شامل آمینواسیدهای گوناگون (پرولین) ، قندها (ساکاروز و فروکتان) ، پلی اول­ها (مانیتول و پنیتول)، آمین­های چهارتایی (گلایسین و بتائین) و اسیدهای آلی (مالات و سیترات) می­باشند. این ترکیبات کوچک و دارای حلالیت بالا در pH فیزیولوژیکی خنثی هستند و در غلظت­های بالا در یاخته هیچ گونه اثر سمی و زیانباری ندارند.(Sharp and (Verslues, 1999 انباشتگی اسمولیت­ها در یاخته­های گیاهی سبب کاهش پتانسیل اسمزی یاخته گردیده و از این رو سبب ادامه و حفظ جذب آب و فشار تورگر می­شوند که برای ادامه برخی از فرآیندهای فیزیولوژیک همچون باز بودن روزنه­ها و ادامه رشد لازم می­باشد (Serraj and Sinclair, 2002). از جمله مکانیسم­هایی که گیاهان در مقابله با تنش بکار می­گیرند سنتز پروتئین­هاست. میزان پروتئین محلول یکی از شاخصه­های مهم وضعیت فیزیولوژی در گیاهان می­باشد. تغییرات هیدراسیون پروتئین یکی از نتایج میزان یون بالا در تنش اسمزی در سلول­های گیاهی محسوب می­ شود (Parvaiz and Satyavati, 2008). برخى از پژوهش­گران رکود سنتز پروتئین را به کاهش تعداد پلى­زوم­هاى سلولى نسبت داده­اند Creelman et al., ۱۹۹۰)). علت افزایش پروتئین ممکن است به این دلیل باشد که تنش باعث تحریک افزایش پروتئین­های موجود گردیده و یا پروتئین­های جدیدی سنتز شده باشند (.(Abolhasani Zeraatkar et al., ۲۰۱۰ تجمع پرولین در یاخته­های گیاهی که تحت تنش خشکی و شوری هستند، یک پدیده طبیعی می­باشد .(Peng and Verma,1996) پرولین در تمام اندام­های گیاه در طی تنش وجود دارد، با این وجود میزان انباشتگی آن در برگها­ سریع­تر و بیشتر از سایر نقاط می­باشد .( Abolhasani Zeraatkar et al., ۲۰۱۰) انباشتگی پرولین همراه با پسابیدگی، یکی از مهم­ترین عکس­العمل­های گیاهان نسبت به کمبود آب یا افزایش فشار اسمزی می­باشد (Abolhasani Zeraatkar et al., ۲۰۱۰). پرولین علاوه بر اینکه به عنوان اسمولیت عمل می­ کند، می ­تواند نقش­های دیگری از جمله محافظت از آنزیم­ها در برابر تغییر ماهیت (Peng and Verma, 1996) حفظ حلالیت پروتئین­ها، تثبیت فسفولیپیدهای غشایی (Walton and Podivinsky, (1998، تنظیم­کننده اسیدیته سیتوپلاسمی (Peng and Verma, 1996) منبع نیتروژن و کربن در یاخته (Walton and (Podivinsky, 1998 ، تنظیم پتانسیل ردوکس یاخته توسط متابولیسم پرولین (Verslues and Sharp, 1999) و موارد دیگر بر عهده داشته باشد. تحت شرایط تنش شدید افزایش چشمگیر غلظت پرولین به همراه کاهش معنى­دار پروتئین در برگهاى سویا را مى­توان هم به تخریب پروتئین و هم کاهش سنتز آن نسبت داد (Hissao, 1973).
( (Sayed, 1992در بررسی­های خود بر روی فلفل بیان داشت که میزان پرولین گیاه در شرایط تنش خشکی به­خصوص در ریشه­ها افزایش می­یابد. بالا رفتن میزان پرولین و کربوهیدرات در بخش­های مختلف گیاهان به نوعی بیانگر فعال­شدن سیستم تنظیم اسمزی در طی مواجه­شدن با تنش می­باشد.
تنش خشکی بر متابولیسم قندها در گیاهان تأثیر می­ گذارد. قندها به صورت­های گوناگون در بردباری به خشکی در گیاهان شرکت می­ کنند. قندها می­توانند به عنوان متابولیت­های سازگار یا اسمولیت­ها سبب تنظیم اسمزی شوند. همچنین سبب پایداری غشا و پروتئین­های در حال خشک­ شدن می­­­گردند، بدین صورت که تثبیت غشاء از طریق جایگزین شدن آب موجود در غشای لیپید­ی دو لایه صورت می­گیرد و به این ترتیب از متراکم شدن فسفولیپیدها جلوگیری کرده و همچنین از پیوندهای نابجا بین پروتئین­های غشایی جلوگیری می­ کنند. پایدارسازی پروتئین­ها نیز از طریق تشکیل پیوندهای هیدروژنی بین گروه ­های کربوکسیل قند و زنجیره­های قطبی پروتئین صورت می­گیرد .(Ingram and Bartles, 1996)تجمع بیش از حد قند در بسیاری از گونه­ های گیاهی در معرض شوری، خشکی و UV-B گزارش شده است (Ranjbarfordoei et al., ۲۰۰۹ ؛Musil et al., ۲۰۰۲). چنین افزایشی به آسیب میتوکندریایی را می توان به کاهش مصرف انرژی تنفسی نسبت داد که برای انباشتگی نشاسته مطلوب می­باشد. طبق نظر کارشناسان انباشتگی سلولی نشاسته، می ­تواند طی چندین مکانیسم همانند:
قطع فیزیکی عملکرد کلروپلاست
بازدارندگی فیدبکی فتوسنتز در اثر کاهش فعالیت روبیسکو
محدودیت فسفات غیرآلی
بازدارنده فتوسنتز باشد و این ممکن است تولید بیومس را کم کند (He et al., ۱۹۹۴). تحقیقات متعددى در زمینه نقش کربوهیدرات­هاى محلول و افزایش آنها تحت شرایط تنش­هاى گوناگون صورت پذیرفته است که همگى بر نقش ترکیبات مذکور در تنظیم اسمزى سلول دلالت دارند .(Wu and Garg, 2003)
۱-۳ کلیاتی در زمینه مسیر درک علامت (Singal transduction) در گیاهان
۱-۳-۱ اثر تنش­های محیطی در فرایند­های مولکولی در گیاهان
گیاهان در پایدار نگه داشتن محیط زمین نقش مهمی ایفا می­نمایند. آنها در طول دوره بلند مدت تکامل و گسترش­شان، مکانیسم­های پیشرفته­ای را برای پاسخ­دهی به تغییرات محیطی اختیار نموده ­اند. این مکانیسم­ها در بسیاری از جنبه­ های آناتومی، فیزیولوژی، بیوشیمیایی، ژنتیک، رشد ­و نمو، تکامل و زیست مولکولی دخیل بوده (Shao et al., ۲۰۰۷a) که نهایتاً طبیعت­شان به بیان ژن در سطح مولکولی برمی­گردد (Shao et al., ۲۰۰۷b). در محیطی با تغییرات مداوم، شرایط بسیار سخت تنش­زا همانند سرما، خشکی، شوری و UV-B (280-320nm) وجود داشته که رشد گیاهی و محصول­دهی را بشدت تحت­ﺗﺄثیر قرار می­ دهند. پاسخ­های مولکولی به یک چنین تنش­های محیطی طی چند سال گذشته به میزان زیادی مورد مطالعه و بررسی قرارگرفته و ثابت شده است ­که یک شبکه پیچیده درمسیر علامت­رسانی وجود دارد که علائم تنش محیطی را درک، پیامبر ثانویه را تولید و انتقال علامت را کنترل می­نماید۲۰۰۳) Shinozaki et al.,). هورمون­های­ گیاهی در این شبکه انتقال، مکان مرکزی را اشغال نموده و غالباً در ارتباط دادن بین سایر علائم فعالیت می­ کنند تا بطور هماهنگ، فرایندهای سلولی را که اساس رشد و نمو گیاهان عالی و همچنین بیان ویژگی­های منحصربه­فردشان است، تنظیم نمایند (Casati and Walbot, 2004). سلول­های گیاهان عالی دارای گیرنده­ها، کانالها، Gپروتئین­ها و کینازها در غشاهای ویژه خود هستند. برخی از کمپلکس­های پروتئینی علامت­رسان غالب­تر­اند نظیر سیگنالوزوم ^[۲۳]COP6 که نسبتاً پایدار بوده و شاید همواره در حال سنتز باشند. سایر کمپلکس­های پروتئینی احتمالاً افمرال^[۲۴]بوده و در نتیجه علامت­دهی تشکیل می­شوند (Shao et al., ۲۰۰۷b). در گیاهان اشکال القاء­کننده تنش زیستی و غیر­زیستی، برخی از مسیرهای علامت­رسانی و پاسخ­گویی مشترک با یکدیگر دارند ( Chinnusamy et al., 2004؛Shao et al., ۲۰۰۵) بنابراین از طریق تاثیر متقابل می توانند اثرات خود را تعدیل نمایند (Shao et al., ۲۰۰۵).
ژن­های القا شده توسط تنش محیطی به­ طور­کلی از لحاظ تولیدات پروتئینی­شان به دو نوع تقسیم می­شوند:
۱-ژن­هایی که محصولات کد کننده­شان سلول­های گیاهی را مقاوم به تنش محیطی می­ کنند، نظیر پروتئین LEA.، پروتئین­های ضد یخ، پروتئین­های تنظیم­کننده اسمز، آنزیم­ های سنتز کننده بتائین، پرولین و سایر تنظیم کنندگان اسمزی.
۲- ژن­هایی که محصولات کد­کننده آنها درتنظیم بیان ژن و انتقال علامت ((Signal transduction نقش مهمی بازی می­ کنند، نظیر عناصر رونویسی برای احساس و انتقال پروتئین­کینازهای MAP،CDP، Bzip،MYB و غیره (Shao et al., 2007b). پیشرفت­های اخیر در ­زمینه ­زیست شناسی ­مولکولی (مخصوصاً DNA microarray)، ژنومیکس، پروتئومیکس و متابولویکس، دیدگاه­ هایی به سمت سیستم شبکه­ ای تنظیم ژن در گیاهان بدست داده است که اساساً متشکل از ژن­های قابل القا، عناصر تنظیمی و کنترلی بیان­شان (cis-element و trans-element)، مسیرهای بیوشیمیایی و عوامل گوناگون علامتی­اند Wang et al., 2003)؛ .(Zhu et al., ۲۰۰۳هدف از استراتژی مهندسی ژنتیک گیاهی که به تازگی بنیان نهاده شده است نیز بر پایه عناصر رونویسی بوده که ویژگی مقاومت را در گیاهان بهبود می­بخشد (Puhakainen et al., ۲۰۰۴).
شکل-۱-۶ - عملکرد ژن­های القایی در تحمل و پاسخ به تنش. محصولات ژن به دو گروه طبقه بندی می­شوند. گروه اول شامل پروتئین­هایی است که احتمالا در تحمل به تنش عمل می­ کنند (پروتئین های عملکردی)، و گروه دوم شامل فاکتورهای پروتئینی درگیر در تنظیم بیشتر Signal transduction و بیان­ژن که احتمالا در پاسخ به تنش عمل می­ کنند (پروتئین­های تنظیمی) ( Shinozaki and .(Yamaguchi-Shinozaki, ۲۰۰۷
تنش­های غیر­زیستی اغلب در قالب خشکی، سرما، یخ زدگی، گرما ، شوری ، کمبود مواد غذایی و تنش مکانیکی رخ می دهند. تنش­های محیطی هرگز به­تنهایی عمل نمی­کنند با این وجود، مطالعات آزمایشگاهی اغلب به پاسخ گیاهان به فاکتورهای تنشی مجزا محدود می­شوند (Shao et al., ۲۰۰۷a). با وجود پژوهش‌های انجام گرفته در تشخیص برخی از ژن‌های مرتبط با تنش و مسیرهای سیگنال‌دهی‌ آن، دانش ما از سازگاری گیاه به تنش‌های غیرزنده همچون خشکی، شوری، دمای غیربهینه و خاک دچار کمبود مواد غذایی، محدود است. بنابراین مهندسی مقاومت به خشکی در گیاهان از اهمیت اقتصادی فوق العاده­ای برخوردار است. برای توسعه استراتژی­ های جدید بدین منظور یکی از مهم­ترین اهداف تحقیقات درک مکانیزم­ های مولکولی سهیم در مقاومت به خشکی گیاهان می­باشد. خشکی پاسخ‌های گوناگون و زیادی را در گیاهان برمی­انگیزد که این پاسخ­ها شامل تغییرات در تظاهر ژن، تجمع متابولیت‌هایی مانند هورمون‌های گیاهی، اسید آبسزیک یا ترکیبات فعال اسمزی و سنتز هورمون­های خاص می­باشد. که از جمله این­ها می­توان پروتئین­های بسیار­آب­دوست، پروتئین­هایی که رادیکال­های اکسیژن را جذب می­ کنند، پروتئین­های چپرون و غیره را نام برد Ramachandra et al., 2004)). اعتقاد بر این است که آنتی­اکسیدان­ها، پروتئین­های تنظیم­شونده با کلسیم و پروتئین­کینازها پس از دریافت تنش، در ترارسانی آبشاری جهت فعال­سازی مسیرهای دفاعی و سازش دخیل می­باشند. با پیشرفت تکنولوژی میکروسکوپی DNA که اجازه آنالیز زیادی را از تظاهر RNA پیغام­بر می­دهد چند صد ژن القاشده توسط تنش و استرس به عنوان ژن­های مسئول مقاومت به خشکی برای مهندسی ژنتیک مشخص شده ­است. از میان ژن­های مشخص شده چندین مورد به عنوان ژن­های تنظیم کننده معرفی شده ­اند.
با وجود اینکه رویکرد­های مرسوم در اصلاح و فیزیولوژی گیاهان اهمیت بسیار زیادی دارد، مهندسی ژنتیک ژن­های تنظیم­کننده اصلی که مقاومت به خشکی و ژن­های مرتبط با مقاومت به خشکی را مدیریت می­نمایند یکی از مهم­ترین استراتژی­ها برای دانشمندان در به حداقل رسانیدن تاثیرات منفی همراه با خشکی به شمار می­رود Vinocur et al., 2005) ).
۱-۳-۲ مسیرهای ژن­های کنترل­ کننده تنش­های غیر­زنده
هورمون ^[۲۵]ABA که تحت شرایط کم­آبی تولید می­ شود نقش مهمی در تحمل به خشکی گیاهان دارد. بر همین اساس مسیر­های اصلی پاسخ به خشکی در گیاهان به ۲ مسیر وابسته به ABA و مستقل از ABA تقسیم شده ­اند. بررسی بیان ژن­های القا­ پذیر به وسیله تنش در گیاه آرابیدوپسیس نشان داده که حداقل ۴ سیستم تنطیمی مستقل برای پاسخ به تنش وجود دارد که عبارتند از : ۱- تنظیم­کنندهDREB 2- تنظیم­کننده NAC و ZF-HD 3- تنظیم­کننده AREB-ABF 4-تنظیم­کننده MYC و MYB. تنظیم­کنندهDREB ، NAC و ZF-HDمستقل از آبسزیک اسید هستند که به تیمار اسید آبسزیک و سرما پاسخ نمی­دهند. تنظیم­کننده­ های MYC و MYB و AREB-ABF وابسته به اسید آبسزیک هستند. با کنترل بیان سیستم تنظیم­کننده­ها، امید می­رود که تحمل گیاهان به تنش­های محیطی را بهبود داد (Nakashima et al., ۲۰۰۵).
شکل-۱-۷- شبکه ­های تنظیمی بیان ژن­های القا پذیر به وسیله تنش­های محیطی .(Nakashima et al., ۲۰۰۵)
۱-۴ ژن­های مورد مطالعه
۱-۴-۱ پروتئین‌کینازها
پروتئین­کیناز آنزیمی است که با افزودن گروه فسفات (فسفوریلاسیون) به پروتئین‌ها در آن‌ها تغییر ایجاد می‌کند. معمولاً فسفوریلاسیون با تغییر فعالیت آنزیمی، موقعیت سلول و یا همکاری با دیگر پروتئین‌ها باعث تغییر در عملکرد پروتئین هدف (سوبسترا) می‌گردد. ژنوم انسان حدوداً دارای ۵۰۰ ژن پروتئین­کیناز است. پروتئین­کینازها همچنین در باکتری‌ها و گیاهان نیز یافت شده‌اند (Manning and Whyte, 2002). فعالیت شیمیایی یک کیناز به‌صورت انتقال یک گروه فسفات از ATP با ایجاد پیوند کووالانت با یکی از سه اسیدآمینه‌ای (سرین^[۲۶]، ترئونین^[۲۷] و تیروزین^[۲۸]) که یک گروه هیدروکسیل آزاد دارند، انجام می‌گیرد (Dhanasekaran and Premkumar, 1998).
وضعیت فسفوریلاسیون پروتئین‌ها می‌تواند اثرات زیادی روی فعالیت آن‌ها و برهمکنش با دیگر پروتئین‌ها داشته باشد. نزدیک به ۱ تا ۳% از ژن‌های یوکاریوت‌ها، رمزکننده پروتئین‌کینازها هستند که نشان می‌دهد، آن‌ها در خیلی از جنبه‌های تنظیم سلولی و متابولیسم درگیر هستند. در گیاهان، فسفوریله شدن پروتئین، در پاسخ به سیگنال‌های مختلف شامل نور، هجوم پاتوژن‌ها، هورمون‌ها، تنش و فقدان مواد غذایی ضروری است ((Stone and Walker, 1995.
شکل-۱-۸- فسفوریلاسیون پروتئین (Dhanasekaran and Premkumar, 1998).
هانکس و هانتر در سال ۱۹۹۵ پروتئین‌کینازها را به پنج گروه اصلی طبقه‌بندی کردند (Hanks and Hunter, 1995):
۱) گروه AGC شامل خانواده وابسته به نوکلئوتید حلقوی (PKG^[29] و ^[۳۰]PKA)، خانواده ^[۳۱]PKC و خانواده S₆ کیناز ریبوزومی. این گروه شامل کینازهای وابسته به نوکلئوتید حلقوی و کینازهای وابسته به فسفولیپید کلسیم است.
۲) گروه ^[۳۲]CaMK. این گروه از پروتئین­کینازها شامل خانواده پروتئین­کینازهای وابسته به کلسیم/کالمودولین هستند و با SNF1/AMP فعال می‌شوند.
۳) گروه CMGC شامل خانواده ^[۳۳]CDK، MAPK^[34]، ^[۳۵] GSK3و ^[۳۶]CKII. تمام این چهار خانواده در گیاهان شناخته شده‌اند. برخلاف گروه ­های AGC و CaMK، تنظیم شدن فعالیت پروتئین­های این گروه با پیامبر ثانویه نمی ­باشد و به صورت فسفریلاسیون آبشاری در فرودست (down stream) تنظیم می­شوند.
۴) گروه PTK^[37]. یک خانواده مهم از تنظیم‌کننده آنزیم‌ها در یوکاریوت‌های عالی هستند. این خانواده از پروتئین­کینازها مخصوص فسفریله کردن تیروزین هستند.
۵) دیگر گروه‌ها. اغلب پروتئین­کینازهای کلون شده در گیاهان که در چهار گروه قبلی جا نمی‌گیرند، دراین دسته طبقه‌بندی
می‌شوند. پروتئین­کینازهای شایع در یوکاریوت‌ها، ^[۳۸]RLKs و ^[۳۹]Tsl در این گروه جای می‌گیرند.
۱-۴-۲ خانواده ژنیMAPK
گیاهان اغلب در طول رشد و نمو خود تحت تاثیر تنش­های مختلفی قرار گرفته و ژن­های دفاعی آن­ها در فرایند پاسخ به تنش درگیر هستند. فسفریلاسیون/دفسفریلاسیون پروتئین یک مکانیسم تنظیم­کنندگی در کنترل فعالیت این ژن­های دفاعی است. آبشار پروتئین­کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) یکی از مهم­ترین مسیرهای فسفریلاسیون بوده که در پائین دست سنسورها/رسپتورها عمل می­ کند و پاسخ­های سلولی را نسبت به محرک­های داخلی و خارجی تنظیم می­ کند (Wang et al., ۲۰۰۷). آبشار پروتئین­کیناز فعال شده با میتوژن (MAPK) یکی از مسیرهای مهم در سلول­های یوکاریوتی بوده به­ طوری­که در پاسخ به محرک­های خارج سلولی فعال می­ شود (Xiong et al., ۲۰۰۶). خانواده MAPK در پاسخ به انواع زیادی از محرک­های خارج سلولی از جمله: پاتوژن­ها، خشکی، شوری، سرما، ازن (O₃)، گونه­ های فعال اکسیژن، محرک­های هورمونی می ­تواند فعال شود (Jonak et al., ۲۰۰۲). MAPK می ­تواند انواعی از سوبستراها از جمله فاکتورهای نسخه برداری، سایر پروتئین­کینازها و پروتئین­های مرتبط با اسکلت سلولی را فسفریله کند (۲۰۰۵ Nakagami et al.,).
MAPKها سرین­ها و ترئونین­های اختصاصی سوبسترای پروتئین هدف را فسفریله کرده و فعالیت­های سلولی اعم از بیان ژن، میتوز، جنبش، متابولیسم و مرگ برنامه­ ریزی شده را تنظیم می­ کنند. کاتالیز فسفریلاسیون در پروتئین­های سوبسترا توسط MAPK به عنوان یک سوئیچ برای خاموش یا روشن کردن فعالیت پروتئین سوبسترا عمل می­ کند. سوبسترا شامل سایر پروتئین­کینازها، فسفولیپازها، فاکتورهای رونویسی و پروتئین های اسکلت سلولی می­باشد. پروتئین­فسفاتازها فسفات هایی را که توسط MAPK به سوبسترای پروتئینی منتقل شده است حذف می­ کنند. یک آبشار MAPK معمولی شامل سه مرحله است:
یک MAP کیناز کیناز کیناز (MAPKKK) یک MAP کیناز کیناز (MAPKK) اختصاصی را از طریق فسفریلاسیون در دو باقیمانده سرین/ ترئونین در یک موتیف حفاظت شده S/T-X3-5-S/T فعال می­ کند، MAPK فعال شده به نوبه­ی خود می ­تواند یک MAPK را در باقیمانده­های ترئونین و تیروزین در توالی ثابت TXY فسفریله کند. گیاهان نسبت به سایر یوکاریوت­ها مجهز به تعداد بیشتری از ژن­های کد­کننده­ MAPKاها می­باشند. به طور مثال، مخمر دارای ۶ ژن کد کننده­ پروتئین­های MAPK، پستانداران دارای ۱۳ تا، گیاه آرابیدوپسیس دارای ۲۳ و برنج دارای ۱۵ تا هستند. تا امروز بیش از ۶۰ MAPK در گیاهان شناخته و جدا شده است و آنالیز توالی­های ژنومی آرابیدوپسیس وجود بیش از ۲۰ ژن MAPK را مشخص کرده که نشان می­دهد آبشار MAPK در گیاهان ممکن است کاملا پیچیده باشد.
شکل-۱-۹- درخت فیلوژنتیکی ­­MAPK­ های آرابیدوپسیس با سایر گونه های گیاهی (Jonak et al., ۲۰۰۲).
بر اساس آنالیز فیلوژنتیکی توالی آمینواسید و فسفریلاسیون موتیف، MAPKهای گیاهی حداقل به چهار گروه (D, C, B, (A تقسیم می­شوند. در بین آنها، گروه ­های A و B تقریبا” در سیگنالینگ تنش­های زیستی و غیر­زیستی مثل سرما، خشکی، زخم، حمله ­پاتوژن و هورمون­ها درگیر هستند. اطلاعات محدودی در مورد MAPK های گروه C در دسترس بوده و به نظر می­رسد که بعضی از آن­ها در تنطیم چرخه­ی سلولی و برخی در پاسخ به تنش­های محیطی دخیل هستند. همه MAPK­های گروه D بجای موتیف TEY دارای موتیف TDY بوده که در زیرگروه­های A و B و C حفاظت شده است. علاوه بر این، آنها دارای یک دمین الحاقی C- ترمینال طولانی می­باشند. گزارش شده است که دو عضو این گروه، OsBWMK1 و MsTDY1، می­توانند توسط حمله پاتوژن و زخم مکانیکی فعال شوند. حقایق فوق نشان می­ دهند که MAPK­ها نقش حیاتی را در رشد ­و­ نمو گیاه بازی می­ کنند. به منظور به دست آوردن اطلاعات بیشتر درباره الگوهای ساختاری و تنظیم اختصاصی ­­­ MAPKها، جداسازی و توصیف ژن­های بیشتر MAPK از گونه­ های مختلف ضروری می­باشد. خصوصیات مولکولی و بیوشیمیایی ژن­های MAPK در گیاهان بطور وسیعی مورد مطالعه قرار گرفته است، اما بسیاری از این مطالعات در گونه­ های مدل گیاهی مانند آرابیدوپسیس، تنباکو و برنج انجام شده است. در گیاهان، MAPKها نه تنها به وسیله­ فسفریلاسیون پس از ترجمه­ای بلکه توسط کنترل نسخه برداری نیز فعال می­شوند، در حالی­که در مخمر و پستانداران فقط به وسیله­ مسیر اول فعال می­شوند. مطالعات بیشتر در سال­های اخیر نشان داده است که فعالیت نسخه برداری ژن­های MAPK گیاهی رایج­تر می­باشد. به طور مثال، ATMPK3 در آرابیدوپسیس و MMK4 در یونجه، هر دو تجمع mRNA را تحت تنش­های خشکی و سرما نشان می­ دهند .(Wang et al., ۲۰۰۷) بسیاری از اطلاعات بدست آمده در مورد وظایف احتمالی MAPKها در سلول­های جانوری و گیاهی از مطالعه روی این آنزیم­ها بدست آمده است. MAPKها برای ورود مجدد به چرخه­ی سلولی از هر دو فاز G1 و G2 مورد نیاز هستند. MAPKهای تحریک شده توسط فاکتورهای رشد با تاثیر بر روی بیان سیکلین اختصاصی-G1 اثرات خود را اعمال می­ کنند. مسیر MAPK در دو نقطه در طول تقسیم سلولی میوز در قورباغه زنوپوس مورد استفاده قرار می­گیرد: