برای تهیه یک لیتر محلول محیط کشت ابتدا ۱۰۰ الی ۲۰۰ میلی لیتر آب مقطر در یک بشر ۱۰۰۰ میلی­لیتری برای جلوگیری از رسوب عناصر غذایی قرار داده شد، سپس محلول‌های عناصر میکرو و ماکرو و ویتامین‌ها که به صورت استوک تهیه شده بود به بشر اضافه شدند. درصورت نیاز تنظیم کننده‌های رشد در این مرحله اضافه می‌گردند. سپس ۳۰ گرم ساکارز به محلول اضافه شد. در مرحله بعد pH محلول به وسیله محلول‌های هیدروکسید پتاسیم و اسید کلریدریک ۱و ۱/۰ مولار روی ۷/۵ یا ۸/۵ تنظیم گردید. به این ترتیب که محلول به­ صورت پیوسته توسط مگنت که در محلول قرار داده می­ شود، روی دستگاه هات پلیت به­هم خورده و سپس با دستگاه pH متر، که از قبل کالیبره شده است، روی pH 7/5 تا ۸/۵ تنظیم شد. اگر pH محلول کم­تر از این مقدار بود به­ وسیله هیدروکسید پتاسیم (KOH) بالا برده می­ شود و در صورت بالا بودن آن با اسیدکلریدریک پایین آورده می­ شود. در مرحله پایانی پس از تنظیم pH، ۷ گرم آگار وزن گردید و به محلول اضافه شد. ارلن حاوی محیط کشت روی شعله چراغ گاز آزمایشگاه قرار داده شد تا به مرحله جوش برسد، تا آگار در آن حل شود. پس از حل شدن آگار، حدود ۱۰ تا ۱۵ دقیقه ارلن حاوی محیط کشت روی میز آزمایشگاه قرار داده شد تا کمی خنک شود سپس از محلول ۱۰ میلی لیتر توسط استوانه مندرج برداشته شد و در شیشه‌های ۱۰۰ میلی­لیتری ریخته و درب آن­ها بسته شد و شیشه‌های کشت در اتوکلاو در دمای ۵/۱۲۱ درجه سانتی گراد و فشار ۱۵ پی اس آی (PSI) به­مدت ۲۰-۱۵ دقیقه استریل شدند.

( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۶-۳ آماده سازی محلول پایه تنظیم­کننده­ های رشد
با توجه به اینکه مقدار تنظیم­کننده­ های رشد مصرفی در تهیه محیط کشت کم است و تهیه این مقدار، نیاز به ترازوهای دقیق دارد که وقت گیر هم است. بنابرین به­ طور معمول برای آن‌ها محلول پایه تهیه می‌شود. به این ترتیب که ۱۰ میلی­گرم از هورمون مورد نظر (BAP، NAA، KIN، IBA، D-4,2) وزن شد و در یک بشر ۱۰۰ میلی لیتری با چند قطره، هیدروکسید پتاسیم و اسید کلریدریک ۱ و ۱/۰ نرمال یا الکل اتیلیک ۹۶% حل گردید و سپس با آب مقطر به حجم ۱۰۰ میلی­لیتر رسانده شد. بدین ترتیب استوک ۱:۱۰ تهیه شد. (۱۰ میلی­لیتر استوک برابر با ۱ میلی­گرم هورمون است) استوک‌های تهیه شده درشیشه‌های دربسته در فریزر ۲۰- درجه ­سانتی ­گراد نگه داری شدند و در زمان مناسب پس از ذوب کردن آن به محیط کشت اضافه گردید. برای ذوب کردن هورمون، شیشه­های حاوی هورمون از فریزر خارج شد و در دمای آزمایشگاه ذوب گردیدند و یا این­که شیشه حاوی هورمون در بشر ۱۰۰ سی­سی قرار داده شد و کمی آب به بشر اضافه گردید. باید توجه داشت که آب اضافه شده به درب شیشه نرسد چون ممکن است وارد شیشه هورمون شده و غلظت آن را تغییر دهد.
جدول ۱-۳ اجزاء و مقادیر تشکیل دهنده محیط کشت موراشیگ و اسکوگ ۱۹۶۲ (MS)