ترازو با دقت ۰/۱ mg
کپسول N2 و CO2
سمپلرهای متغیر
پیپت دهانی
تانک ازت
پیپتور (BoEco)
تایمر
استراو
پتری دیش ۶۰ میلی متری
پتری دیش ۳۰ میلی متری
لام
لامل
سرنگ انسولین
۲-۲- مواد
۱- ازت مایع
۲- BSA (Sigma,USA)
۳- PMSG ساخت شرکت Folligon ، هلند
۴- HCG ساخت شرکت Folligon ، هلند
۵- روغن معدنی[۷۶] (Embryonic) ساخت شرکت Folligon ، هلند
۶- سوکروز[۷۷] (Sigma,USA)
۷- اتیلن گلایکول[۷۸]
۸- محیط کشت HTF مواد مورد استفاده در این محیط کشت تماما تولید شرکت Sigma می باشد
۹- پلیت
۱۰- ذرت
۱۱- گندم
تمام ظروف یک بار مصرف از شرکت های TPP و Falcon تهیه شده است.
تمام محلول های کشت در PH= 7/2 و اسمولاریته ۲۶۵-۲۷۵ mosm تنظیم گردیدند.
محیط های موجود به صورت روزانه ساخته می شد و حداقل دو ساعت قبل از مصرف در دیش های مربوطه قطره گذاری می شدند و در زیر روغن معدنی جهت انکوبه شدن در انکوباتور قرار می گرفت.
لایه روغن به عنوان بخشی از سیستم کشت اعمال زیر را انجام می دهد:
روغن به عنوان یک سد فیزیکی[۷۹] عمل می کند و قطرات محیط کشت را از پاتوژن ها و ذرات موجود در اتمسفر پیرامون جدا می کند.
روغن مانع تبخیر[۸۰] شده و انتشار گاز[۸۱] را به تاخیر می اندازد و بدین ترتیب از تغییرات PH، درجه حرارت و اسمولاریته محیط کشت که در طی دست کاری[۸۲] جنین و یا گامت ها ایجاد می شود در زیر خود محافظت می کند.
روغن می تواند با برداشتن توکسین های محلول در چربی[۸۳] از محیط کشت به رشد و نمو جنین ها کمک کند. از طرف دیگر لایه کامل روغن مانع انتشار محصولات فرعی[۸۴] نظیر آمونیاک می شود و بدین ترتیب غلظت آمونیاک را که برای جنین سمی است در محیط کشت جنین کاهش می دهد.
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۲-۳- حیوانات آزمایشگاهی
برای انجام این مطالعه از موشهای سوری نژاد NMRI ماده بارور جوان ۱۰-۶ هفته ای و نر ۱۲-۸ هفته ای استفاده شد که در شرایط استاندارد با رعایت دمای ۲±۲۲ درجه سانتیگراد، رطوبت ۶۰-۳۰ درصد و با سیکل نوری، ۱۴ ساعت روشنایی و ۱۰ ساعت تاریکی نگهداری شد. آب و غذا بصورت آزاد در دسترس بود.
این مطالعه بر روی جنینهای حاصل از لقاح آزمایشگاهی صورت گرفت که نیاز به تحریک تخمک گذاری داشتند و به شرح زیر صورت گرفت :
پس از اطمینان از انجام تنظیم چرخه نوری که برای تنظیم سیکل جنسی ضروری است و حداقل بمدت ۲ هفته به طول میانجامد، موشهای ماده بالغ جوان آماده تحریک تخمک گذاری شدند.
۲-۳- ۱- زمان تزریق گنادوتروپین ها
زمانی که PMSG و HCG تزریق می شوند وابسته به یکدیگر و سیکل روشنایی- تاریکی حیوان آزمایشگاهی است. برای اکثر سویه های موش سوری، ۴۸-۴۶ ساعت فاصله بین تزریق PMSG و تزریق HCG بهترین تعداد تخمک را نتیجه می دهد. برای کنترل درست زمان تخمک گذاری این مهم است که HCG قبل از آزاد شدن LH آندروژن تزریق شود، زمانیکه LH در پاسخ به PMSG آزاد می شود به وسیله ی سیکل روشنایی- تاریکی تنظیم می گردد. بنابراین، قبل از تزریق PMSG موش باید چندین روز تحت شرایط روشنایی- تاریکی قرار بگیرد. زمان آزاد شدن LH بستگی به سویه دارد اما برای اکثر سویه ها بین ۲۰-۱۵ ساعت بعد از دومین دوره تاریکی به دنبال تزریق PMSG است. بنابراین معمولا ۴۸- ۴۶ ساعت بعد از تزریق PMSG (3-2 ساعت قبل از رهایی LH ) بهترین زمان برای تزریق HCG است.
۲-۳- ۲- آماده سازی موش برای IVF
موش های هر گروه به طور جداگانه و در فاصله های زمانی مختلف جهت گرفتن اووسیت بالغ تحت تحریک تخمدانی قرار گرفتند. جهت انجام این مطالعه تزریق ۵/۷ واحد هورمون PMSG[85] (ساخت شرکت Folligon ، هلند) به حجم ۱/۰ میلیلیتر، و ۴۸-۴۶ ساعت بعد تزریق ۵/۷ واحد هورمون HCG[86] (ساخت شرکت Folligon، هلند) به حجم ۱/۰ میلیلیتربه روش داخل صفاقی(IP[87]) صورت گرفت. عمل تخمکگذاری معمولا ۱۲-۱۰ ساعت بعد از تزریق HCG صورت میگیرد.
۲-۴- آماده سازی محیط کشت برای IVF
روز پیش از لقاح محیط کشت های لازم برای انجام عمل لقاح تهیه شده و به مدت ۱۲ ساعت در انکوباتور با ترکیب گازی ۵% CO2 و دمای ۳۷ درجه سانتی گراد قرار می گرفت. برای هر کدام از گروه ها دیش های مجزایی برای لقاح آماده می شد. دیش های لقاح با محیط کشت HTF که با(sigma) 4 mg/ml BSA[88]ترکیب شده بود قطره گذاری می شدند. یک قطره ۵۰۰ میکرولیتری در هر دیش برای لقاح و چندین قطره ۱۰۰ میکرولیتری برای شستشو در دیش های IVF گذاشته می شدند و روی سطح آنها با روغن معدنی (Mineral oil, sigma) پوشانیده می شد.(تصویر ۲-۱)
قطره لقاح (۵۰۰ میکرو لیتر)
قطرات شستشو
(۱۰۰ میکرو لیتر)
قطرات کشت (۱۰۰ میکرو لیتر)
تصویر۲-۱- نمایی از ظرف لقاح و کشت را نشان می دهد
گروه های مختلف برای انجام IVC (In vitro culture) بعد از لقاح در یک نوع محیط، کشت یافتند که این دیش های کشت (IVC) ، همان HTF ترکیب شده با BSA که در دیش های IVF مورد استفاده قرار گرفته بود به صورت ۱۰۰ میکرولیتری قطره گذاری شدند.
جدول ۲-۱- : طرز تهیه محیط کشت HTF
