کلیه مواد شیمیایی و حلالهای مورد استفاده در این پژوهش:
دی متیل سولفوکساید[۴۱]، متانول، مولر هینتون آگار[۴۲]، مولر هینتون براث[۴۳]، نوترینت براث[۴۴]، نوترینت آگار[۴۵]، نیتروبلو تترازولیوم کلراید[۴۶] از شرکت مرک[۴۷] و اسیدآسکوربیک، فریک کلراید، تری کلرو استیکاسید، پتاسیم فریسیانید، بافر فسفات، دیفنیل پیکریل هیدرازیل، اسیدگالیک، کربنات سدیم، یدید پتاسیم، فولین-سیوکالتیو، ید، سود، فنیل فتالئین، روی، اسید کلریدریک، آمونیاک، سدیم کلراید، کلروفریک، اتیلاتر با درجه خلوص بالا تهیه شد.
دستگاههای مورد استفاده در این پژوهش:
اسپکتروفتومتر، انکوباتور، آسیاب برقی، روتاری، شیکر، هود لامینارفلو، ورتکس، یخچال، اتوکلاو، ترازو دیجیتال آزمایشگاهی، ترازو دیجیتال با دقت ۰۰۰۱/۰ گرم، سانتریفیوژ، بنماری، آون و PH متر بود.
۲-۲ تهیه گیاهان مورد بررسی و تعیین نام علمی آنها
گیاهان مورد مطالعه در این پژوهش: بادام کوهی (Amygdalus scoparia)، بومادران (Achillea millefolium)، کلپوره (Teucrium polium)، گلپر (Heracleum persicum) و مریمگلی (Salvia officinalis).
تعیین نام علمی: این مرحله بسیار حساس بوده و لزوما باید توسط شخص مجرب و متخصص صورت گیرد. جهت تعیین نام علمی نیاز به وجود یک یا چند نمونه از گیاه می باشد. گیاه شناس ابتدا به تشخیص راسته، تیره و سپس جنس گیاه پرداخته که در صورت وجود نمونه کامل و مناسب تا این مرحله شناسایی سریعا انجام می گیرد. تعیین گونه و احیانا واریته دقت زیادی را می طلبد و به کمک کتب مرجع، مقایسه با دیگر نمونه های هرباریومی و بررسی میکروسکوپی و غیره صورت می گیرد. پس از شناسایی نام علمی توسط متخصصین گیاهشناس، نمونهها به آزمایشگاه فیزیولوژی برای آزمایشهای میکروبی منتقل شد.
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
آسیاب کردن: بخشهای مورد استفاده خشکشده این گیاهان جهت تهیه عصاره، به وسیله آسیاب برقی خرد شده و با بهره گرفتن از الک به صورت پودر درآمدند تا سطح تماس بیشتری با حلال داشته باشند.
۲-۳ استخراج عصاره متانولی
پودر ۱۰۰ گرم از بخشهای مختلف رویشی و زایشی گیاهان مورد بررسی، در ۵۰۰ میلیلیتر متانول ۸۰% به مدّت ۴۸ ساعت روی دستگاه شیکر (مخلوط را یکنواخت میگرداند) در دمای ۴۰-۳۷ درجه سانتی گراد با دور ۲۷۰ در دقیقه به روش ماسراسیون، عصارهگیری شدند. دلیل استفاده از خیساندن، عدم آسیب مواد موجود در عصاره تهیه شده از گیاهان بوده است [۷۸]. در طول این فرایند سعی شد تا با همزدن، عصاره یکنواختی حاصل شود [۷۹]. عصاره حاصل با کاغذ واتمن ۴/۰ میکرونی صاف گردید. بقایای گیاهی مجددا با متانول به مدت ۲۴ ساعت دیگر با همان شرایط قبلی تحت عملیات استخراج قرار گرفت و محلول صاف شده به عصاره اولیه اضافه شد. عصاره متانولی تحت شرایط خلاء در دمای ۵۰ درجه سانتی گراد با دور ۸ در دقیقه توسط دستگاه روتاری[۴۸] تغلیظ و در پتری دیشهای استریل ریخته و در دمای ۵۰ درجه سانتی گراد آون خشک گردید [۸۰]. عصارهها پس از سپریشدن ۴ روز به صورت خشک با نسبت وزنی متفاوت از گیاهان مختلف تهیه شدند.
۲-۴ روش تهیه محیطهای کشت
محیط کشت جامد مولر هینتون آگار:(۶٫۸ g/ 200 ml) 34 g/ l
محیط کشت مایع مولر هینتون براث: (۲٫۱ g/ 100 ml) 21 g/ l
محیط کشت نوترینت آگار: ۵۲ g/ l
محیط کشت نوترینت براث: ۳۷ g/ l
مقدار معینی از محیط کشت را با آب مقطر استریل به حجم رسانیده و پس از سترونکردن با اتوکلاو در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد جهت ادامه کار مورد استفاده قرار میدهیم.
۲-۵ استریلیزاسیون محیطهای کشت میکروبی، ظروف و مواد مصرفی
تمامی وسایل و مواد مورد نیازی که قبل از استفاده، نیاز به سترونشدن دارند از جمله: فالکن، میکروتیوب، لولههای آزمایش، سرسمپلر و محیطهای کشت جامد و مایع قبل از تلقیح باکتری به مدت ۱۵ دقیقه در دمای ۱۲۱ درجه سانتی گراد اتوکلاو شدند. محلولهای ذخیره نمکهای فلزات و حلالهای آلی به این دلیل که سترونسازی از طریق اتوکلاو می تواند منجر به تغییر ساختار نمک و یا تبخیر حلال شود، به وسیله فیلتر ۲/۰ میکرونی استریل شدند.
۲-۶ احیاء باکتری
قبل از هر آزمون میکروبی، زیر هود لامینارفلو قسمت های سطحی هود با پنبه آغشته به الکل ۷۰% استریل و به مدت ۲۰ دقیقه تحت اشعه UV قرار گرفت. آمپول لیوفیلیزه حاوی میکروارگانیسمهای مورد مطالعه را در شرایط استریل شکسته و با حدود ۲-۱ میلیلیتر محیط کشت نوترینت براث به صورت سوسپانسیون درآمد. چند قطره از این سوسپانسیون توسط سرنگ استریل به محیط کشت جامد نوترینت آگار منتقل گردید تا بعد از رشد ۲۴-۱۸ ساعته در گرمخانه دما به عنوان کشت ذخیره[۴۹] از آن استفاده گردد.
۲-۷ تهیه کشت تازه (در فاز لگاریتمی) از میکروارگانیسمها
هر یک از سویههای باکتریایی یک روز قبل از انجام آزمون میکروبی بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار ذکر شده، کشت سطحی داده شدند تا میکروارگانیسمها پس از یک شب انکوباسیون در هنگام تهیه سوسپانسیون میکروبی در فاز لگاریتمی قرار داشته باشند.
۲-۸ تهیه استاندارد نیم مکفارلند[۵۰]
۵/۰ میلیلیتر از کلرید باریم[۵۱] ۱۷۵/۱% با ۵/۹ میلیلیتر اسید سولفوریک ۱% را داخل لوله آزمایش استریل دربدار اضافه و توسط دستگاه ورتکس هم زده شد. تعداد تقریبی باکتری ها ۱۵۰۰ میلیون در میلیلیتر است. این محیط به مدت ۶ ماه در تاریکی و در ظروف درببسته می تواند مورد استفاده قرار گیرد اما با این اوصاف، اگر در هر زمان رسوبی در لوله مشاهده شد، محیط غیر قابل استفاده خواهد بود.
۲-۹ تهیه سوسپانسیون میکروبی
به وسیله لوپ از کلنی هرکدام از باکتری ها برداشته و در یک لوله آزمایش استریل حاوی ۹ میلیلیتر سرم فیزیولوژی استریل (یا محلول نمکی NaCl 8.5 g/ l) کاملا مخلوط کرده به طوری که سوسپانسیون کاملا یکنواختی از باکتری مورد آزمایش بهدست آید. سپس جذب نوری این سوسپانسیون در طول موج ۶۲۵ نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر، در مقابل بلانک خوانده می شود تا کدورتی معادل استاندارد ۵/۰ مک فارلند ۱۰۸ ×۵/۱ داشته باشد.
۲-۱۰ آزمونهای میکروبی
۲-۱۰-۱ تست دیسک دیفیوژن
حساسیت میکروارگانیسمهای بیمارستانی به عصارهها با بهره گرفتن از روش نفوذ انتشاری[۵۲] بررسی گردید. جهت انجام این آزمایش، مقدار مشخصی از عصارههای خشک گیاهی در حلال DMSO استریل شده، حل و سپس غلظتهای ۱۰۰۰، ۷۵۰، ۵۰۰، ۲۵۰ و ۱۲۵ میلیگرم بر میلیلیتر تهیه شدند. در روش کیفی نفوذ انتشاری از روش بائر کربی[۵۳] استفاده شد [۸۱]. ۱۰۰ میکرولیتر سوسپانسیون باکتریایی روی سطح محیط کشت مولر هینتون آگار چکانده شد و با یک سوآپ کتان استریل روی محیط گسترش یافت. دیسکهای خام استریل به قطر ۶ میلیمتر توسط پنس استریل روی سطح محیط کشت در زیر دستگاه لامینارفلو به فاصله معین از یکدیگر و از لبه پلیت قرار داده شد و ۲۰ میکرولیتر از محلول عصارهها با غلظتهای مشخص روی دیسکها چکانده شد. در این آزمایش دیسک حاوی آنتیبیوتیکهای مورد مطالعه به عنوان شاهد مثبت و دیسکهای حاوی DMSO به عنوان شاهد منفی استفاده شد. پلیتها به مدت ۲۴ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی گراد انکوبه شدند [۸۲]. از آن جایی که عصارهها دارای رنگ بودند، با توجه به انتشار رنگ در محیط توانستیم انتشار عصاره را نیز ردیابی کنیم. اندازه گیری قطر هاله عدم رشد زیر نظر کارشناس متخصص آزمایشگاه و در شرایط آسپتیک با بهره گرفتن از خطکش ثبت شد.
شکل ۲-۱: اندازه گیری قطر هاله عدم رشد با خطکش میلیمتری
برای حصول اطمینان، این آزمایش برای هر سویه باکتری سه بار تکرار گردید و میانگین قطر هاله عدم رشد به عنوان قطر نهایی ثبت شد. قطر هاله عدم رشد کمتر از ۷ به عنوان مقاوم، ۹-۷ نسبتا مقاوم، ۱۲-۱۰ نسبتا حسّاس و بیشتر از ۱۲ میلیمتر به عنوان حسّاس در نظر گرفته شد شکل (۲-۱) [۸۳].
۲-۱۰-۲ تست آنتیبیوگرام
به دلیل عدم وجود یک استاندارد خاص در مورد میزان استفاده از عصاره گیاهی از دیسکهای آنتیبیوتیکی به عنوان یک استاندارد و شاهد استفاده شد. جهت بررسی حساسیت سویهها به آنتیبیوتیکهای استاندارد مورد مطالعه، ۱۰۰ میکرولیتر از سوسپانسیون تهیه شده را به روش سطحی روی محیط کشت مولر هینتون آگار کشت داده و سپس دیسکهای آنتیبیوتیک را در فاصلههای معین روی محیط قرار داده و پلیتها به مدت ۲۴ ساعت جهت بررسی هاله عدم رشد در شرایط میکروآئروفیلیک گرمخانهگذاری شدند [۸۷-۸۴]. با اندازه گیری قطر هاله عدم رشد به سادگی میتوان حساسیت باکتری ها نسبت به آنتیبیوتیک را تعیین نمود. تست آنتیبیوگرام با مقاوم[۵۴]، نیمهحساس[۵۵] و حساس[۵۶] گزارش می شود.
۲-۱۰-۳ تعیین حداقل غلظت بازدارندگی[۵۷]و حداقل غلظت کشندگی[۵۸]
جهت انجام آزمایشهای کمی برای حداقل غلظت بازدارندگی از رشد میکروارگانیسم [۸۸] و حداقل غلظت کشندگی میکروارگانیسم [۸۹] از روش رقت لولهای[۵۹] استفاده شد.
MIC: غلظتی از یک عصاره است که می تواند از رشد باکتری در شرایط آزمایشگاهی جلوگیری کند.
MBC: کمترین غلظتی از عصاره که می تواند سبب نابودی بیشترین تعداد باکتری (۹/۹۹%) شود.
۲-۱۰-۳-۱ تعیین MIC عصاره
برای تعیین MIC با روش رقت لولهای از یک سری لولههای آزمایش ۱۰ تایی استفاده شد. ۷ لوله برای غلظتهای مختلف هر عصاره گیاهی و یک لوله به عنوان کنترل مثبت (حاوی سوسپانسیون میکروبی و DMSO فاقد عصاره)، یک لوله به عنوان کنترل مثبت مثبت (حاوی سوسپانسیون میکروبی فاقد عصاره) و یک لوله به عنوان کنترل منفی (دارای محیط کشت و عصاره بدون سوسپانسیون میکروبی) در نظر گرفته شد.
به هر کدام از لولهها cc1 محیط کشت مولر هینتون براث اضافه و به لوله اول cc1 عصاره استوک با غلظت ۱۰۰۰ میلیگرم بر میلیلیتر اضافه گردید. پس از مخلوط کردن، cc1 از لوله اول به لوله دوم و سپس cc1 از لوله دوم به لوله سوم، بههمین ترتیب تا لوله هشتم انجام شد و سرانجام cc1 از آن به بیرون ریخته شد. به تمامی لولهها ۵۰ میکرولیتر از هر سوسپانسیون میکروبی اضافه گردید [۹۰، ۹۱]. به این ترتیب غلظت عصاره در لولههای ۱ تا ۸: ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶۲/۱۵، ۸/۷ و ۹/۳ میلیگرم بر میلیلیتر بود. تمامی لولهها به مدّت ۲۴ ساعت در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی گراد قرار گرفتند. پس از گذشت مدت زمان لازم پلیتها از گرمخانه خارج و جهت تعیین MIC مورد بررسی قرار میگیرند.
برای تعیین MIC عصارهها از محلول ۵ میلیگرم بر میلیلیتر نیتروبلو تترازولیوم کلراید، مقدار ۵۰ میکرولیتر در تمام لولههای آزمایش ریخته و مجددا به مدت ۳ ساعت در گرمخانه انکوبه میشوند. یک غلظت بالاتر از آخرین غلظتی که رنگ بنفش تترازولیوم را به خود گرفته، به عنوان MIC عصاره برای میکروب مورد نظر، در نظر گرفته می شود [۹۲].
۲-۱۰-۳-۲ تعیین MBC عصاره
به منظور تعیین MBC عصاره از هر کدام از لولههای آزمایش که رنگ بنفش نگرفتهاند ۵ میکرولیتر بر روی محیط کشت مولر هینتون آگار انتقال داده می شود سپس پلیتها به مدت ۲۴ ساعت در گرمخانه ۳۷ درجه قرار داده میشوند. پس از گذشت زمان لازم پلیتها از گرمخانه خارج و نتایج آن بررسی می شود. غلظتی که در آن رشدی دیده نشود، به عنوان MBC عصاره برای میکروب مورد نظر گرفته می شود [۹۳].
۲-۱۱ بررسی خواص فیتوشیمیایی اولیه
برای انجام این آزمایشات غلظتهای ۵۰۰، ۲۵۰، ۱۲۵، ۵/۶۲، ۲۵/۳۱، ۶/۱۵ و ۸/۷ میلیگرم برمیلیلیتر از عصاره خشک گیاهان مورد مطالعه به منظور بررسی وجود آلکالوئید، تانن، ساپونین و آنتوسیانین به شرح ذیل به کار گرفته شد.
۲-۱۱-۱ آلکالوئید
۲۵۰ میلیلیتر از غلظتهای مختلف عصاره گیاهان تهیه و ۵ میلیلیتر اسید کلریدریک ۱% به آنها اضافه و به مدت ۵ دقیقه جوشانده و سپس حجم به میزان اولیه رسانده شد و محلول اسیدی حاصل با کاغذ صافی، صاف گردید. محلول حاصل توسط مقدار مناسب آمونیاک ۱۰% قلیایی و با اتیل اتر استخراج گردید. محلول اتری تا حد خشک تبخیر و به آن ۵ میلیلیتر اسیدکلریدریک ۱% افزوده شد. سپس محلول اسیدی حاصل به ۳ قسمت تقسیم گردید. ۱ قسمت به عنوان شاهد در نظر گرفته شد و به ۲ قسمت دیگر معرف بوشاردا و مایر اضافه گردید. تشکیل رسوب سفید مایل به زرد با افزایش معرف مایر و تشکیل رسوب قهوهای رنگ با افزودن معرف بوشاردا نشان دهنده آلکالوئید است [۹۴، ۹۵].
۲-۱۱-۱-۱- معرف مایر
۲۰ گرم سود را داخل ۲۰۰ سیسی آب مقطر حل کرده و ۱ گرم فنیل فتالئین به آن اضافه میکنیم تا یک محلول ارغوانی به دست آید. سپس ۲۰ گرم پودر روی را به آن میافزائیم و هم میزنیم تا کاملا حل شود. بعد محتویات را حرارت میدهیم. برای اینکه آب آن تبخیر نشود، یک بشر را وارونه روی ظرف حاوی محلول میگذاریم تا بخار به داخل ظرف برگردد. محلول را تا زمانی حرارت میدهیم که رنگ ارغوانی از بین برود و مایع شفاف شود. این محلول را پس از سرد شدن میتوان در شیشۀ قهوهای رنگ داخل یخچال نگهداری میکنیم و همچنین به عنوان نگهدارنده میتوان مقداری پودر روی، داخل شیشه بریزیم.
