۲-۷-۱- الکتروفورز ژل آگارز
الکتروفورز ژل آگارز یک روش از الکتروفورز ژل مورد استفاده در بیوشیمی، زیست شناسی مولکولی، و شیمی بالینی به منظور جدا کردن جمعیتی از DNA و پروتئین های مخلوط شده در یک ماتریکس آگارز است. پروتئین ها ممکن است توسط شارژ و یا اندازه، و قطعاتی از DNA و RNA توسط طول از هم جدا شده باشند. مولکول های زیستی بر اساس اندازه در ماتریکس ژل آگارز از هم جدا می شوند (شکل۲-۲).
شکل۲-۲- قطعه ژل آگارز در تانک الکتروفورز با باندهایی از رنگ هایی که پیشرفت الکتروفورز را نشان می دهند.
۲-۷-۲- طرز تهیه بافر TBE 5x :
۵۴ گرم Tris-base، ۵/۲۷ گرم بوریک اسید و ۳۸/۵ گرم اتیلن دی آمین تترا استات ۵/۰ مولار با pH= 8 را با هم در یک ارلن ۱۰۰۰ میلی لیتر مخلوط می کنیم، به هنگام مصرف در الکتروفورز و تهیه ژل، بسته به اندازه حجم مورد نظر آن را رقیق می کنیم.
۲-۷-۳- روش الکتروفورز ژل آگارز:
به منظور انجام الکتروفورز بر روی نمونه های مورد مطالعه جهت تأئید DNA استخراج شده، ژل آگارز یک درصد به روش زیر تهیه شد:
۴/۰ گرم آگارز با ۴۰ سی سی بافر TBE 0.5 X مخلوط و بر روی Hot plate گذاشته شد تا آگارز در بافر حل شده و به جوش آید. سپس آن را از روی Hot plate برداشته و وقتی که دمای آن به ۶۰-۵۰ درجه سانتی گراد رسید، ۵/۳ میکرولیتر اتیدیوم بروماید باغلظت mg/µl 10 به آن اضافه کرده و در قالبی که از قبل آماده شده ریخته شد. پس از سرد شدن ژل، شانه را با دقت از ژل جدا کرده و ژل را درون تانک حاوی بافر قرار داده، به گونه ای که بافر روی سطح ژل قرار گیرد.
سپس هر یک میکرولیتر از DNA را با دو میکرولیتر لودینگ بافر مخلوط کرده و درون چاهک ها ریخته شد. تانک به منبع تغذیه طوری متصل شد که چاهک ها به سمت قطب منفی قرار گیرند. به این ترتیب، به مدت ۵۰ دقیقه نمونه ها با ولتاژ ۹۰ ولت الکتروفورز شدند.
۲-۸-Polymerase Chain Reaction (واکنش زنجیره ای پلی مراز)
واکنش زنجیره ای پلی مراز (PCR) یک تکنولوژی زیست شیمی در زیست شناسی مولکولی برای تکثیر یک یا چند نسخه از یک قطعه DNA که هزاران تا میلیون ها نسخه از یک توالی DNA خاص تولید می کند. این تکنیک در سال ۱۹۸۳ توسط کری مولیس توسعه داده شد، (PCR) در حال حاضر یک روش معمول و اغلب ضروری است که در آزمایشگاههای تحقیقاتی پزشکی و زیست شناسی برای انواع برنامه های کاربردی استفاده می شود. این خدمات شامل کلونینگ DNA برای تعیین توالی، فیلوژنی مبتنی بر DNA، آنالیز عملکردی ژن، تشخیص بیماری های ارثی، شناسایی اثر انگشت ژنتیکی (مورد استفاده در علوم پزشکی قانونی و تست ابوت)؛ و شناسایی و تشخیص بیماری های عفونی می- باشد. در سال ۱۹۹۳، به مولیس به همراه مایکل اسمیت به دلیل ابداع روش PCR جایزه نوبل شیمی عطا شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

تکنیک PCR، روشی متکی بر چرخه حرارتی است که شامل چرخه هایی از افزایش و کاهش دما مکرر واکنش برای دناتوراسیون DNA و تکثیر آنزیمی DNA می شود. پرایمر ها (قطعات DNA کوتاه) شامل توالی مکمل برای منطقه هدف، به همراه یک DNA پلی مراز اجزاء کلیدی هستند که تکثیر انتخابی و مکرر را فراهم می کنند. همانطور که PCR در حال پیشرفت است، DNA ایجاد شده خود را به عنوان یک الگو برای تکثیر مورد استفاده قرار داده و باعث شروع حرکت یک واکنش زنجیره ای می شود که در آن DNA الگو به صورت تصاعدی زیاد می گردد.
۲-۸-۱- اصول PCR
PCR برای تکثیر یک منطقه خاص از یک رشته DNA استفاده می شود(DNA هدف). اکثر روش- های PCR به طور معمول قطعات DNA بین ۱/۰ تا ۱۰ کیلو جفت باز (KB) را تکثیر می کند، اگرچه برخی از تکنیک ها تکثیر قطعات تا ۴۰ کیلو جفت باز از نظر اندازه را اجازه می دهد. مقدار محصول تکثیر شده توسط سوبستراهای موجود در واکنش تعیین می شود، که این مقدار با پیشرفت واکنش محدود می شود.
راه اندازی یک PCR معمول به چندین جزء و مواد آزمایشی نیاز دارد. این اجزاء عبارتند از:

• • DNA الگو که ناحیه ای (هدف) از DNA که تکثیر می شود را شامل شده است.

• • دو پرایمر که مکمل انتهاهای ‘۳ هر یک از رشته های Sense و Anti-Sense از DNA هدف هستند.

• • پلی مراز Taq یا هر DNA پلی مراز دیگری با دمای بهینه حدود ۷۰ درجه سانتی گراد.

• • داکسی نوکلئوزید تری فسفات (dNTP)، بعضی اوقات داکسی نوکلئوتید نامیده می شود؛ بلوک های ساختمانی که DNA پلی مراز از آنها یک رشته DNA جدید را سنتز می کند.

• • محلول بافر، یک محیط شیمیایی مناسب برای فعالیت بهینه و پایداری DNA پلی مراز فراهم می- کند.

• • کاتیون های دوقطبی، منیزیم یا یون های منگنز؛ به طور کلی Mg²⁺ استفاده می شود، اما Mn²⁺ نیز می تواند برای جهش زایی DNA با واسطه PCR مورد استفاده قرار گیرد، نظر با اینکه غلظت بالاتر Mn²⁺ میزان خطا در طول سنتز DNA را افزایش می دهد.

• • کاتیون های تک قطبی یون های پتاسیم.

۲-۸-۲- روش PCR
به طور معمول، PCR یکسری تغییرات دمایی مکرر را شامل شده که چرخه نامیده می شود هر چرخه شامل ۳ مرحله دمایی مجزا شده می باشد. چرخه ها اغلب توسط یک مرحله دمایی واحد (دناتوراسیون اولیه) در درجه حرارت بالا (۹۵-۹۴ درجه) شروع شده، و توسط یک نگه داشتن در انتها برای توسعه محصول نهایی دنبال می شود (توسعه نهایی).
درجه حرارت مورد استفاده و طول زمانی که در هر چرخه اعمال شده به تنوعی از پارامتر ها بستگی دارد. این موارد آنزیمی که برای سنتز DNA استفاده می شود، غلظت یون های دوظرفیتی و dNTP در واکنش و دمای ذوب ™ پرایمرها را شامل می شود.

• • مرحله دناتوراسیون اولیه: این مرحله شامل حرارت دادن واکنش به دمای ۹۶-۹۴ درجه سانتی گراد است (یا ۹۸ درجه سانتی گراد اگر پلی مراز های به شدت مقاوم به حرارت استفاده شود)، که این دما برای مدت ۹-۱ دقیقه نگه داشته می شود. این مرحله فقط برای DNA پلی مراز هایی مورد نیاز است که نیاز به فعال سازی حرارت توسط hot-start PCR دارند.

• • مرحله دناتوره شدن (denaturation) : این مرحله اولین رویداد چرخه زنی منظم است و شامل حرارت دادن واکنش به ۹۸-۹۴ درجه سانتی گراد به مدت ۶۰-۲۰ ثانیه است. این امر باعث ذوب شدن DNA الگو توسط جدا کردن پیوند های هیدروژنی بین بازهای مکمل است و مولکول های DNA تک رشته ای می سازد.

• • مرحله اتصال پرایمرها (annealing) : دمای واکنش به ۷۲-۵۰ درجه سانتی گراد به مدت ۶۰-۲۰ ثانیه کاهش داده می شود که اجازه اتصال پرایمرها به DNA الگو تک رشته ای را می دهد. به طور معمول دمای اتصال در حدود ۵-۳ درجه سانتی گراد کمتر از TM پرایمر مورد استفاده است. پیوند های هیدروژنی DNA-DNA پایدار فقط زمانی شکل می گیرد که توالی پرایمر بسیار نزدیک و منطبق بر توالی الگو باشد. پلی مراز به هیبرید پرایمر-الگو متصل می شود و تشکیل DNA شروع می شود.

• • مرحله توسعه/طویل شدن (extension) : درجه حرارت در این مرحله بستگی به DNA پلی مراز استفاده شده دارد؛ Taq پلی مراز در دمای ۸۰-۷۵ درجه سانتی گراد فعالیت بهینه دارد، و معمولاً درجه حرارت ۷۲ درجه سانتی گراد مورد استفاده این آنزیم قرار می گیرد. در این مرحله DNA پلی مراز یک رشته DNA جدید مکمل رشته DNA الگو توسط اضافه کردن dNTPs که مکمل جهت ‘۵ به ‘۳ الگو هستند سنتز می کند (شکل ۲-۳). زمان توسعه به DNA پلی مراز مورد استفاده و طول DNA تکثیر شده بستگی دارد.

شکل۲-۳- طرح شماتیکی از چرخه PCR

• • ازدیاد طول نهایی (Final extension) : این مرحله واحد در حرارت ۷۲ درجه به مدت ۱۵-۵ دقیقه پس از آخرین چرخه برای اطمینان اینکه هر DNA تک رشته ای باقی مانده به طور کامل توسعه یابد انجام می شود.

• • نگه داشتن نهایی: این مرحله در ۴ درجه سانتی گراد برای مدت زمان نا محدود ممکن است برای ذخیره سازی کوتاه مدت واکنش به کار گرفته شود.

۲-۹- Amplification refractory mutation system (ARMS)
سیستم ARMS یک استراتژی تکثیر است که در آن پرایمر واکنش زنجیره ای پلی مراز PCR به گونه ای طراحی شده که قادر به تبعیض قائل شدن میان الگو هایی است که توسط واحد های تک نوکلئوتیدی متمایز هستند، ARMS همچنین PCR آلل-خاص یا تکثیر PCR آلل های خاص (PASA) نامیده شده است. بنابراین، یک پرایمر ARMS می تواند برای تکثیر یک آلل خاص از یک سیستم چند آللی طراحی شود؛ در حالی که برای تکثیر آلل دیگری که ممکن است به کوچکی یک باز از حالت پیشین doffer (گردش) داشته باشد مقاوم باقی بماند. مزیت اصلی ARMS این است که مرحله تکثیر و مراحل تشخیصی با هم ترکیب شده اند، که در آن حضور یک محصول تکثیر شده، حضور یک آلل خاص را نشان می دهد و بالعکس. برای تشخیص معمولی، این ویژگی ARMS بدین معنی است که یک روش کارآمدتر در صرفه جویی زمان است. با این حال، ترکیب مراحل تشخیصی و تکثیر به یک سیستم، ممکن است به همان قدرتمندی بعضی از روش ها که در آن این دو مرحله مهم از هم جدا شده، نباشد، به عنوان مثال، PCR که توسط آنالیز آنزیم محدودکننده دنبال شده است. ARMS نیز به کمک آنزیم Taq انجام می شود؛ DNA پلی مرازی که به طور معمول در PCR مورد استفاده قرار می گیرد و فاقد فعالیت اگزونوکلئازی ‘۳ به ‘۵ است؛ بنابراین عدم تطابق بین انتهای ‘۳ پرایمرهای PCR و الگو منجر به کاهش بازده تکثیر خواهد شد (شکل ۲-۴).
ARMS-PCR تترا پرایمر، دو جفت پرایمر برای تکثیر دو آلل در یک واکنش PCR را به کار می گیرد. پرایمرها به طوری طراحی شده که زوج های دو پرایمری در یک محل پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی با هم همپوشانی دارند اما هریک با تنها یکی از پلی مورفیسم های تک نوکلئوتیدی کاملاً جور می باشد. به عنوان یک نتیجه، اگر یک آلل معین در واکنش زنجیره ای پلی مراز موجود باشد، جفت پرایمر خاص برای آن آلل محصول تولید می کنند اما برای آلل متناوب با پلی مورفیسم تک نوکلئوتیدی متفاوت محصول تولید نمی کنند. جفت های دو پرایمری نیز به طوری طراحی شده که محصولات واکنش زنجیره ای پلی مراز آنها دارای طول های به طور قابل توجهی متفاوت هستند که اجازه می دهد باند ها بر روی ژل الکتروفورز به راحتی تشخیص داده شود.
۲-۴-طرح شماتیکی از ARMS
در روش ARMS دو واکنش PCR با بهره گرفتن از یک DNA الگو انجام می شود، که در هر واکنش پرایمر مشترک به همراه یکی از دو پرایمر اختصاصی آلل مورد استفاده قرار می گیرد. در یک واکنش پرایمری استفاده می شود که تکثیر را از روی یک آلل انجام می دهد و در واکنش دوم پرایمر دوم استفاده می شود که آلل حالت دوم را تکثیر می کند. حالت اختصاصی این پرایمر ها برای هر یک از آلل ها ناشی از نوکلئوتید ʹ۳ آنها است که با هم متفاوت بوده و در واقع مربوط به محل متفاوت بین دو آلل می باشد.
جدول۲-۱: پرایمرهای مورد استفاده جهت انجام ARMS PCR