مواد استفاده شده
مقدار مواد
پلی‌اکریل‌آمید (۵/۳۸ درصد)
۱۷ میلی لیتر
TBE (1X)
۴۸ میلی لیتر
APS (10%)
TEMED
۶۵۰ میکرو لیتر
۷۰ میکرو لیتر
در این پژوهش از دستگاه الکتروفورز عمودی مدل VSTA-1002M استفاده شد. قطر ژل در این پژوهش ۲ میلی‌متر و ابعاد ژل ۳۵×۲۵ سانتی‌متر بوده است. ابتدا شیشه‌های مخصوص آن کاملا با آب شسته و به الکل آغشته و سپس با یک دستمال عاری از هر گونه کرک و آلودگی خشک شد. فضاسازهایآغشته به وازلین روی شیشه زیرین قرار داده شد و سپس شیشه رویی نیز روی فضا سازها و شیشه زیرین قرار گرفت. برای این‌که دو شیشه به همراه فضاسازها خوب به همدیگر بچسبند از گیره‌های مخصوص استفاده شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
محلول آماده شده با دقت داخل شیشه مخصوص تانک عمودی الکتروفورز ریخته و سپس شانه مخصوص به آرامی داخل شیشه و روی ژل قرار داده شد. به گونه‌ای که از تشکیل حباب در زیر شانه جلوگیری شود. زیرا مانعی جهت حرکت باندها در داخل ژل به خوبی حرکت نکنند. همچنین در هنگام ریختن ژل درون شیشه‌ها باید به این نکته مهم توجه کرد که مواد به صورت یکنواخت حل شده باشند، در صورت یکنواخت نبودن محلول، کمانی شدن حرکت باندها روی ژل مشاهده می‌شود. پس از تزریق محلول ژل به داخل شیشه‌ها مدتی صبر کرده تا ژل درون شیشه ببندد. سپس شیشه در یخچال قرار داده شد تا ژل خنک شود و چاهک‌هابه خوبی شکل بگیرند.
بعد از قرار گرفتن ژل در تانک عمودی ۵ میکرولیتر از محصول PCR با ۷ میکرولیتر از بافر بارگذاری مخلوط و داخل چاهک‌هاریخته شد (برای SSCP محصول PCR را به همراه بافر به مدت ۱۰ دقیقه داخل دستگاه PCR با دمای ۹۰ درجه سانتی گراد قرار داده تا DNA تک رشته ای شود). ژل اکریلامید به مدت ۱۸ ساعت با ولتاژ ۴۰۰ و در دمای ۴ درجه سانتی گراد الکتروفورز شد.
۳-۶-۲- محلول‌های مورد نیاز برای رنگ آمیزی ژل پلی‌اکریل‌آمید
۳-۶-۲-۱- رنگ آمیزی با نیترات نقره
ژل پلی‌اکریل‌آمید با بهره گرفتن از نیترات نقره رنگ‌آمیزی شد. در این روش اگرچه باندها با وضوح بیشتری قابل مشاهده هستند اما این روش نسبت به رنگ آمیزی با اتیدیوم بروماید گران‌تر می‌باشد. رنگ آمیزی نیترات نقره حساسیت بیشتری نسبت به رنگ‌آمیزی ژل آگارز (اتیدیوم بروماید) داشته و علاوه براین ژل پلی‌اکریل‌آمید مدت طولانی‌تری قابل نگهداری است.
۳-۶-۲-۲- مراحل رنگ‌آمیزی نیترات نقره
پس از سپری شدن زمان لازم برای الکتروفورز عمودی، بافر تانک تخلیه شده و گیره‌ها باز شدند. سپس شیشه‌ها از دستگاه جدا شد. شیشه‌ها را روی یک سطح صاف قرار داده و به آرامی از هم جدا می‌کنیم. برای رنگ آمیزی ژل پلی‌اکریل‌آمید از سه محلول استفاده شد که عبارت‌اند از:
۳-۶-۲-۲-۱- محلول تثبیت کننده
جدول ۳-۹- مواد لازم برای تهیه محلول تثبیت کننده
مواد استفاده شده
مقدار مواد
آب مقطر
اتانول (۹۶ درصد)
اسید استیک (۱۰ درصد)
۳۶۰ میلی لیتر
۴۰ میلی لیتر
۲ میلی لیتر
۳-۶-۲-۲-۲- محلول رنگ‌آمیزی
جدول ۳-۱۰- مواد لازم برای تهیه محلول رنگ‌آمیزی
