۲

۱

۴

فر مالدئید۲۰% ml

۱

۱

۱

۱

۱

کربنات پتاسیم ml

۳

۳

۳

۳

۳

تولوئن ml

۱۰

۱۰

۱۰

۱۰

۱۰

۲- ۴-۴- اندازه گیری هیستامین

۲-۴-۴-۱- کالیبراسیون دستگاه HPLC

۲-۴-۴-۱- ۱- منحنی های کالیبراسیون

بر اساس حدود غلظت هیستامین در نمونه های اصلی، مقادیر مناسب از استاندارد هیستامین از محلول استاندارد کاری برداشته، به لوله شیشه ای منتقل و با جریان ملایم نیتروژن خشک گردید. طبق روش ذکر شده در بخش ۲-۴-۴-۳ مشتق سازی و طبق بخش ۲-۴-۴-۴ با دو تکرار به دستگاه تزریق شد.
منحنی کالیبراسیون بصورت معادله خطی y ) y = ax+b: میانگین سطح زیر منحنی هر غلظت بر حسب x , mV*sec: غلظت بر حسب ppm) به روش Least Square با بهره گرفتن از نرم افزار Excell محاسبه و رسم گردید. ضریب همبستگی (R²) نیز برای بررسی میزان خطی بودن نتایج توسط همین نرم افزار محاسبه شده که در فضای منحنی کالیبراسیون توسط دستگاه نمایش داده شده است.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۲-۴-۴-۱-۲- نمونه خالی^[۵۶]

به موازات آنالیز شیمیایی نمونه ها (مراحل۲-۴-۴-۲ تا ۲-۴-۴-۴) ۱۰ میلی‌لیتر TCA 5 درصد را برداشته و این مراحل را در کنار نمونه های اصلی انجام می دهیم. این نمونه نباید هیچ پیکی مشابه با زمان ماندگاری هیستامین داشته باشد. از این نمونه به عنوان استاندارد صفر در بخش۲-۴-۴-۱-۱ استفاده شد.

۲-۴-۴-۲- استخراج^[۵۷]

استخراج هیستامین بر اساس روش Mietz وKarmas ارائه شده در سال ۱۹۷۸ که برای سایر آمین های بیوژن نیز صدق می کند، انجام شد و شرح آن بدین صورت است:
۵۰ گرم نمونه ماهی با ۷۵ میلی لیتر TCA ۵ درصد (۵ گرم در ۱۰۰ میلی‌لیتر آب) توسط مخلوط کن Waring به مدت ۲ دقیقه مخلوط، سپس محتوی آن به لوله های سانتریفیوژ منتقل و به مدت ۱۰ دقیقه در سرعت ۴۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. فاز بالایی توسط قیفی که روی آن پشم‌شیشه قرار دارد صاف و به بالن حجمی ۲۵۰ میلی لیتری منتقل شد. ماده مانده در ته لوله سانتریفیوژ به مخلوط کن برگردانده و با اضافه کردن ۷۵ میلی لیتر TCA ۵ درصد مراحل فوق تکرار گردید. عمل استخراج برای بار سوم نیز صورت گرفت تا این مرحله حجم کل به ۲۲۵ میلی لیتر رسید با مقداری TCA ۵ درصد قیف شسته شده و با همان TCA محلول به حجم (۲۵۰ میلی‌لیتر) رسید. این مخلوط در حقیقت رقت ۲/۰ نمونه ماهی است و می توان آن را ۲ تا ۳ هفته در یخچال نگهداری نمود
۱۰ میلی لیتر از هر محلول نمونه (معادل ۲ گرم نمونه)، ۱۰ میلی لیتر TCA ۵ درصد (به عنوان نمونه شاهد)، همانطور که در بخش ۳-۳-۱-۲ بیان شد، به لوله هایی جداگانه ۳۰ تا ۵۰ میلی لیتری سانتریفیوژ با در شیشه ای که قبلاً ۴ گرم NaCl، ۱ میلی لیتر NaOH ۵۰ درصد و ۵ میلی لیتر کلروفرم-بوتانول (۱+۱) به آن اضافه شده منتقل گردید. سپس ۲ دقیقه به شدت تکان داده شد. سپس به مدت ۵ دقیقه در ۳۰۰۰ دور سانتریفیوژ شد. فاز بالایی (آلی) به قیف جدا کننده ۶۰ میلی لیتری منتقل گردید. این مرحله استخراج نیز در مجموع سه بار تکرار شد. حال به مجموع استخراجها در قیف، ۱۵ میلی لیتر n-هپتان و سپس ۱ میلی لیتر اسید کلریدریک ۲/۰ نرمال اضافه و قیف به شدت تکان داده شد. در مرحله بعد فاز پایینی (آبی) به لوله ۱۰ میلی لیتری با در شیشه ای منتقل گردید. این عمل نیز در کل ۳ بار تکرار شد. در مرحله بعد ۱ میلی لیتر آب مقطر به قیف اضافه شد و به همان صورت استخراج گردید تا از جداسازی کامل هیستامین اطمینان حاصل گردد لوله محتوی این استخراجها در حمام آب داغ (۸۰ درجه سانتی گراد) قرار داده شد تا با کمک جریان ملایم هوا و یا ترجیحاً گاز نیتروژن محلول خشک گردد؛ به علاوه می‌توان از حمام بخار نیز بدین منظور استفاده نمود.

۲-۴-۴-۳- مشتق سازی^[۵۸]

روش مورد استفاده در این آزمایش بر اساس روش مورد استفاده توسط Dawood و همکاران در سال ۱۹۸۸ می باشد که در زیر بیان می‌شود:
به ماده خشک باقیمانده در بخش ۲-۴-۴-۲ یا استانداردها که در بخش۲-۴-۴-۱-۱ بیان شد، ۱میلی لیتر NaOH ۲ مولار اضافه شد. سپس توسط میکروپیپت، ۵ میکرولیتر بنزویل کلراید اضافه و بخوبی توسط ورتکس مخلوط گردید. سپس اجازه داده شد تا محلول به مدت ۲۰ دقیقه بماند. بعد ۲ میلی لیتر محلول NaCl اشباع اضافه کرده تا عمل مشتق سازی متوقف گردد. ۲ میلی لیتر دی اتیل اتر اضافه، و بخوبی تکان داده شد. سپس به مدت ۵ دقیقه در ۲۵۰۰ دور سانتریفیوژ گردید. بعد فاز بالایی (اتر) به لوله تمیز منتقل و با جریان ملایم گاز نیتروژن تبخیر گردید تا خشک شود.

۲-۴-۴-۴- تزریق و آنالیز دستگاهی با HPLC

این مرحله از آزمایش نیز بر اساس روشی است که توسط Dawood و همکاران در سال ۱۹۸۸ انجام شد:
در این مرحله به ماده خشک باقیمانده، بخش۲-۴-۴-۳، ۲۰۰ میکرولیتر متانول اضافه کرده و از فیلترمیلی پور با قطر منافذ ۴۵/۰ میکرومتر عبور داده و سپس ۲۰ میکرولیتر از این محلول با سرنگ میکرولیتری Hamilton به دستگاه تزریق گردید. اساس سنجش جداسازی هیستامین استفاده از جذب UV در ۲۵۴ نانومتر، استفاده از فاز معکوس با سیستم ایزوکراتیک^[۵۹] متانول و آب (به نسبت حجمی ۷۰ و ۳۰) با جریان حلال ۱/۱ میلی لیتر در دقیقه در درجه حررات معمول اتاق می‌باشد. سایر تنظیمات دستگاهی بدین صورت است:

• AUFS (Absorbance Unit Full Scale) = 0.200

• Polarity: + Data mode = Absorbance