۵/۰ گرم
۱/۰ گرم
۰۱/۰ گرم
۴۴گرم
-
Ml2

۳ گرم
۵/۱ گرم
۵/۰گرم
۱/۰گرم
۰۱/۰ گرم
۴۴گرم
۵%
Ml2

این محیط کشت محیط اختصاصی باکتریهای اکسیدکننده آهن می­باشد. (Johnson, 1995):
نمکهای محیط کشت را در اتوکلاو با دمای ۱۲۱ C⁰و به مدت ۱۵ دقیقه استریل شد و محلول آهن نیز توسط فیلتر استریل شد و نهایتا دو محلول به هم اضافه شد. برای محیط کشت جامد نیز آگارز را به طور جداگانه استریل کرده و به محلول نمکها و آهن اضافه گردید و سپس در پلیت ریخته شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۲-نمونه برداری
نمونه برداری در تاریخ ۲۰/۲/۱۳۹۲ از سد باطله­ها و قسمتهای اصلی پیت معدن(دیواره های شرقی و غربی معدن) سنگ آهن گل گهر انجام شد. دمای منطقه نمونه برداری شده C⁰38 و pH منطقه بین ۵ تا ۷ ( در بیشتر مناطق ۷) بود. نمونه­های برداشته شده از سد باطله، قسمت­ های، دیواره شرقی و غربی معدن، محل­های جمع شدن آب در معدن و همچنین از آب جاری موجود در معدن گرفته شد. در مجموع ۸ نمونه از جاهای مختلف معدن برداشته شد که برای از بین نرفتن باکتریهای نمونه­ها، درب ظروف نمونه گیری به صورتی بسته شد که هوا در آن جریان داشته باشد. ظروف نمونه گیری ، تا زمان رسیدن به آزمایشگاه در یخچال و دمایC⁰ ۴ نگهداری گردید.
۳-۳-کشت اولیه از نمونه­ها:
بعد از آماده سازی محیط کشت ۹k محلول، نمونه­های منتقل شده به آزمایشگاه سریعاً به محیط کشت منتقل شد، محیط کشت ۹K محیط کشت اختصاصی برای رشد باکتری­ های اکسید کننده آهن می­باشد. نمونه­هایی که به صورت مخلوطی از آب و خاک است، در ابتدا به صورت یک محلول یکدست همزده شد ، به میزان ml95 از محیط کشت در ارلن ۵۰۰ ریخته شد و از هر یک از نمونه­ها، در صورت مایع بودن نمونه ml5 و در صورت جامد بودن آن ۵ گرم به هر یک از ارلن­های ml500 حاوی ml 95 محیط کشت اضافه شد و pH محیط مجددا روی ۸/۱ تنظیم شد. بعد از آن ارلن­ها در شیکر انکوباتور با میزان دور rpm110 و دمایC⁰32 قرار گرفت. و هر روز به مدت یک هفته میزان pH و E_h محیط اندازه ­گیری شد.
۳-۳-۱-غنی سازی
بعد از گذشت ۱۶ روز از کشت اولیه نمونه­ها، محیط کشت جدید ساخته شد و از هر یک از نمونه ها به مقدار ml20 به محیط کشت جدید منتقل شد. هدف از انجام این مرحله، افزایش جمعیت تعداد باکتری ­های اکسیدکننده از ارلن­ها جهت جداسازی نهایی بود. ارلن­های جدید با شرایط قبلی، rpm110 و دمای C⁰32 با ۸/۱pH مجددا در شیکر انکوباتور قرار گرفت. مقادیر pH و E_h هر روز اندازه ­گیری شد.
۳-۳-۲-جداسازی باکتری­ ها از طریق کشت­های متوالی
بعد از انجام مرحله غنی سازی، هر ۱۴ روز یک بار به میزان ml5 از ارلن­های قبل به محیط های جدید برده شد. و باشرایط قبل در شیکر انکوباتور گرماگذاری گردید. به منظور بررسی وجود باکتری انجام این مرحله ضروری می­باشد. در صورت رشد کردن باکتری در محیط کشت، رنگ محیط از سبز روشن به قرمز تیره تغییر کند، زیرا باکتری از آهن موجود در محیط برای رشد خود استفاده می­ کند. همچنین مقادیر pH و E_h نیز اندازه ­گیری شد.
۳-۳-۳-بررسی حضور باکتری از طریق لام معلق
بعد از گذشت دو هفته از نمونه­های ارلن ها، به منظور حضور باکتری در محیط برداشته شد و با لام نئوبار و معلق بررسی شد. برای مشاهده حضور باکتری میزان ml1 از محیط کشت را در ویال­های ml5/1 ریخته و با دور ۱۲۰۰۰ سانتریفیوژ کرده و از محل رسوب ویال یک قطره برداشته شد و روی لامل قرار گرفت. بعد از آن اطراف لامل را روغن زده تا اینکه لامل به لام معلق متصل شود، سپس لام معلق را به صورتی بر روی لامل قرار داده که قطره روی لامل به صورت معلق در فضای خالی لام قرار گرفت. بعد از آن لام با بزرگنمایی ۱۰۰۰ زیر میکروسکوپ مشاهده شد.
۳-۴-اندازه ­گیری pH و Eh
بعد از تلقیح باکتری به محیط کشت اندازه ­گیری این دو پارامتر بسیار مهم است، زیرا عملکرد باکتری بر روی این دو پارامتر بسیار تأثیرگذار می­باشد، بعد از تلقیح باکتری توسط pH متر استریل، pH محیط کشت اندازه گرفته شد. E_h محیط را توسط E_hمتر با الکترود Ag/AgCl اندازه گیری گردید.
۳-۵-شناسایی جدایه بدست آمده:
۳-۵-۱-شناسایی مولکولی جدایه به دست آمده
۳-۵-۱-۱-استخراج DNA
شناسایی مولکولی روشی دقیق برای شناسایی و تشخیص باکتری می­باشد. این شناسایی حاصل بررسی­های ژنومی و تعیین ترادف و خویشاوندی باکتریها با هم و همچنین کارایی­ها و قابلیت ­های باکتری، بدلیل حفظ توالی در زمان طولانی، بکار می­رود که شامل مراحل زیر است:
در این روش ابتدا باید DNA باکتری به طور خالص استخراج شود که برای این منظور از کیت Gen all کره استفاده گردید، که دستورالعمل آن مطابق زیر است:
۱-ابتدا ارلن­ها را به مدت چند ساعت بی­حرکت در جایی گذاشته تا مواد محیط کشت ته نشین گردد
۲- سپس مایع رویی ارلن را درون فالکونml50 ریخته و به مدت ۲ دقیقه با دور ۲۰۰۰ سانتریفیوژ گردید.
۳- از محلول رویی فالکون­ها به میزان ml5/1 درون ویال­های ml5/1 ریخته و با دور ۱۲۰۰۰ به مدت ۵ دقیقه میکروفیوژ گردید.
۴- رسوب سلولی با سرم فیزیولوژی شستشو داده شد توده سلولی درون ویال استریل ۵/۱ ریخته و μl 950 از Lysis buffer به رسوب اضافه می­ شود.
۵- پس از چند ثانیه ورتکس ، ویال در انکوباتور ۳۷ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۰ دقیقه گرماگذاری شد.
۶- به سوسپانسیون حاصل μl100 تا ۲۰۰ SDS 10% افزوده شده و ۱۵ دقیقه در حمام آب­گرم با دمای C⁰60 قرار داده شد.
۷- بقایای سلولی با سانتریفیوژ در rpm 13000 به مدت ۵ دقیقه از عصاره سلولی جدا شدند.
۸- هم حجم محلول رویی، فنل-کلروفرم (۱:۱) جهت رسوب و جداسازی پروتئین­ها اضافه شد و به خوبی مخلوط شد تا رنگ شیری یکنواختی حاصل شود.
۹- سپس به مدت ۵ دقیقه در rpm13000 سانتریفیوژ شد. . در این هنگام دو فاز مایع بر روی هم تشکیل می شود که فاز بالایی، محلول آبی و حاوی DNA است و محلول پایینی فنل-کلروفرم است. بین این دو فاز رسوب سفید پروتئینی مشاهده می شود.
۱۰- محلول رویی برداشته شد و به اندازه ۱/۰ حجم آن سدیم‌استات M 3 اضافه گردید و به‌خوبی مخلوط شد.
۱۱- ۳ برابر حجم محلول حاصل، اتانول مطلق سرد اضافه گردید و پس از ۳۰ دقیقه انکوباسیون در ºC 20- مجددا در شرایط ذکر شده سانتریفوژ شد.
۱۲- رسوب حاصل با ml 5/0 اتانول ۷۰% سرد شستشو داده شد و دوباره سانتریفوژ شد. مایع رویی دور ریخته شد و رسوب در بافر TE حل شد و تا زمان مصرف در ºC20- نگهداری شد (Kieser T, 2000).
۳-۵-۱-۲-الکتروفورز ژل آگارز
به منظور بررسی استخراج DNA، الکتروفورز نمونه روی ژل‌آگارز ۸/۰% صورت گرفت. برای تهیه ژل‌آگارز، g 1/0 آگارز به ml 12 بافر x 1 TAE ( mM Tris/Acetate40، mM EDTA 1 با ۸ pH) افزوده و حرارت داده شد تا بجوشد و پس از کمی سرد شدن به درون ظرف الکتروفورز که قبلا شانه گذاری شده بود، ریخته شد. پس از سرد و جامد شدن ژل در ظرف الکتروفورز، شانه خارج شده و ظرف در دستگاه الکتروفورز حاوی بافر x1 TAE قرار داده شد. در الکتروفورز DNA از رنگ بارگذاری^[۶۰] استفاده شد که مولکول‌های DNA قبل از بارگذاری در ژل به نسبت ۱:۵ با آن مخلوط شدند. پس از اتمام الکتروفورز با ولتاژ v/cm 5-1 ، ژل‌آگارز با اتیدیوم‌برماید رنگ‌آمیزی شده و با دستگاه ژل‌داک^[۶۱]، از آن تصویربرداری شد (Kiesser T, 2000).
۳-۵-۱-۳-انجام واکنش PCR