۳-۱۰- SDS-PAGE

پس از جمع آوری باکتریهای ترانسفرم شده با پلاسمید نوترکیب و همچنین با پلاسمید غیر نوترکیب (به عنوان کنترل منفی) باکتری ها سه بار با بافر PBS در دور ۳۰۰g شستشو داده شده. سپس به آن لودینگ بافر ۵x اضافه شد و به مدت ۷ دقیقه در آب جوش حرارت داده شد. سپس به مدت ۱۰ دقیقه در ۱۰۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفوژ شده و از مایع رویی برای بررسی بیان استفاده گردید.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

مواد مورد نیاز:
محلول آکریل آمید
Temed
آمونیوم پرسولفات
بافر تریس گلایسین
بافر نمونه
Set الکتروفورز
روش کار:
در ابتدا ژل متراکم کننده(Stacking or spacer gel) 10 درصد و ژل جداکننده (Resolving or separating gel) 15 درصد تهیه شدند.
پس از بسته شدن کامل ژل شیشه بر تانک الکتروفورز سوار گردید.
سپس بافر الکتروفورز را در محفظه های بالا و پایین ریخته و حباب های هوا با کمک سرنگ بزرگ خارج شد.
نمونه ها با بافر بارگذاری مخلوط شده و به مدت ۵ دقیقه در آب جوش قرار داده شدند.
مقدار مناسب از نمونه ها و مارکر پروتئین درون چاهک ها ریخته شد.
ولتاژ دستگاه در ابتدا روی ۸۰ و سپس روی ۱۰۰ ولت تنظیم گردید.
پس از اتمام الکتروفورز فژل از روی صفحه شیشه ای برداشته شده و برای وسترن بلات اقدام گردید.

۳-۱۱-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس کم

برای بیان پروتئین نوترکیب HPV ، پس از تهیه باکتری های مستعد از میزبان بیانی، ترانسفورم این باکتری ها با پلاسمید PET28a(+)-HPV انجام شد و بیان پروتئین نوترکیب در آن به کمک IPTG یک میلی مولار القا گردید.
مواد و وسایل مورد نیاز:
۱- باکتری بیانی E.coli BL21 DE3 .
۲- محلول ها و ملزومات برای تهیه سلول های مستعد
۳- محلول ها و ملزومات برای ترانسفورماسیون
۴- پلاسمید نوترکیب (در اینجا PET28a(+)-HPV )
*این پلاسمید طبق روش ذکر شده در قسمت های قبلی استخراج گردید.
۵- آنتی بیوتیک مناسب
*کانامایسین(۱۰۰µg/ml)
به این منظور با حل کردن ۱g پودر کانامایسین در۱۰ml آب مقطر استریل تزریقی ،یک استوک با غلظت ۱۰۰mg/ml تهیه کرده و به ازای هر ۱ml از محیط کشت مقدار ۱µl از استوک آنتی بیوتیک اضافه شد.
۶- محیط کشت LB مایع
۷- محیط کشت LB آگار
۸- محیط کشت ۲xYT مایع
۹- استوک IPTG(1M)(FermentaseTQiagen)
۱۰- اسپکتروفتومتر
۱۱-انکوباتور
۱۲- سمپلر،سرسمپلر و فالکون استریل و اپندورف استریل

۳-۱۲-کشت انبوه سویه بیانی و تهیه جسم سلولی

پس از این مراحل که برای تایید و ارزیابی پروتئین تولید شده از یک کلونی انتخاب شده کشت انبوه در LB broth به مقدار ۱ لیتر تهیه شد،القا با IPTG صورت گرفت و بعد از ۴ ساعت از کل کشت جسم سلولی تهیه شد.در مرحله بعد از جسم سلولی باکتری‌ها به روش Denaturing وRefolding پروتئین ها تخلیص شدند.

۳-۱۳-بیان پروتئین نوترکیب HPV واکسن کاندید چند اپی توپی در مقیاس بالا

کشت باکتری در یک لیتر محیط کشت انجام شد و پس از رسیدن به OD مناسب ۸/۰ و القاء با IPTG یک میلی مولار رسوب باکتریایی آن جمع آوری شد.
مواد و وسایل مورد نیاز:
۱- استوک باکتری بیانی حاوی وکتور نوترکیب
۲- محیط کشت مایع ۲xYT به همراه گلوکز یک درصدحاوی ۱۰۰ میکروگرم در میلی لیتر کانامایسین(برای ۱ لیتر)
۳-IPTG (1mM)(Qiagen)
۴- انکوباتور
۵- سانتریفوژ
۶- سرسمپلرفاپندورف و فالکون استریل
روش کار:
۱-مقدار lµ۱۰۰ از استوک سلول های بیانی دارای وکتور نوترکیب موجود در ۷۰- درجه سانتی گراد در۱۰ml محیط کشت مایع ۲xYT حاوی گلوکز یک درصدحاوی کانامایسین کشت داده شد و یک شب در انکوباتور ۳۰ درجه سانتی گراد قرار گرفت.
۲-صبحlµ۲×۳۰۰ از باکتری های کشت شب گذشته در ۲×۵ml محیط کشت مایع ۲xYT حاوی گلوکز ۱ درصد حاوی کانامایسین کشت داده شد و برای رشد باکتری و اشباع کامل محیط، حدود ۳-۲ ساعت در ۳۰ درجه سانتی گراد انکوبه گردید.
۳-هر یک از محیط های کشت ۵ml اشباع شده به حجم ۵۰۰ml رسید و مجددا برای رشد باکتری در ۳۰ درجه سانتی گراد انکوبه گردید.
۴-وقتی OD600 (جذب نوری در طول موج ۶۰۰nm) در محیط کشت به ۸/۰ رسید، محتویات فوق به مدت ۲۰ دقیقه در یخچال قرار گرفت.