در این روش به جای محیط مایع از محیط جامد استفاده می‌شود و نسبت به روش لوله دقت کم‌تری دارد. در این روش غلظت‌های مختلفی از عوامل ضد قارچی به داخل پلیت‌های آگار وارد شده و برای هر غلظت یک پیپت مورد استفاده قرار می‌گیرد. از میکروارگانیسم مورد آزمایش در سرم فیزیولوژی به گونه‌ای حل کرده که کدورتی کمی بیش از استاندارد ۱ مک فارلند باشد، سپس به وسیله‌ی یک آنس یا لوپ مقدار کمی از محلول قارچی را برداشته و در درون یک حفره تعبیه شده بر سطح آگار قرار می‌دهند. بعد از یک شب گرم خانه‌گذاری رشد میکروارگانیسم‌ها در پلیت‌های فاقد غلظت کافی از عوامل ضد قارچی بررسی شده و در نهایت کمترین غلظت عامل مورد نظر که اجازه رشد به میکروارگانیسم‌ها نداده است به عنوان MICتعیین می‌گردد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))
۲-۵-۳-۱-۳٫ روش گرادیانت پلیت(Solid dilution or Gradient plate method)
در این روش از محیط جامد به جای محیط مایع استفاده می‌شود. ممکن است برای هر یک از غلظت‌های ماده‌ی مورد آزمایش چندین میکروارگانیسم بررسی شود تلقیح کننده‌های چند نقطه‌ای قادرند که چندین میکروارگانیسم را بر روی یک پلیت بررسی کنند.(۳۹)
جهت انجام این تست به محیط، نوترینت آگار ذوب شده از محلول مورد آزمایش اضافه می‌شود. سپس این مجموعه را به داخل پلیت استریلی ریخته، پلیت را کج قرار داده تا محیط داخلی آن به صورت یک گوه (Wedge)سبقت شود، سپس باقی مانده‌ی آگار به داخل کوه ریخته می‌شود و با قرار دادن پلیت برروی محیط صاف آگار به صورت صاف، در پلیت قرار می‌گیرد. پلیت‌ها را یک شب در گرم‌خانه گذاشته تا محلول مورد آزمایش به سطح خشک نفوذ کند. میکروارگانیسم‌های مورد آزمایش باید به طور خطی از سمت بالاترین غلظت به پایین‌ترین غلظت حرکت کنند. در این روش امکان بررسی شش میکروارگانیسم وجود دارد.(۳۹)
برای ارزیابی نتایج، طول رشد قارچ و طول کلی آگار سطحی که کشت داده شده اندازهگیری می‌شود. (۳۹)
۲-۵-۳-۲٫روش کدورت سنجی(Rurbidometric methods)
این روش در مورد ترکیباتی به کار می‌رود که قدرت انتشار آن‌ها به داخل آگار کم باشد در این روش از محیط کشت مایع استفاده می‌شود و کشت میکروارگانیسم‌های مورد نظر در محیط کشت مایع و در مجاورت غلظت‌های مختلف از ماده‌ی ضد قارچی مورد نظر و با سنجش کدورت‌های حاصل در لوله‌ها می‌توان مقدار ماده‌ی مورد آزمایش را تعیین نمود. (۳۶)
در این روش به علت اینکه مدت کشت در گرم‌خانه کوتاه است، کنترل حرارت گرم‌خانه مهم است. حرارت باید کاملاً یکنواخت بوده به این منظور می‌توان از بن‌ماری مجهز به دستگاه دوران آب استفاده نمود. برای سنجش کدورت از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده می‌شود. (۳۶)
باید دقت شود لوله‌ها هم قطر و هم ضخامت باشد خراش، لکه یا هر گونه عیبی در لوله نباشد. قطرهای مختلف، اختلاف دمایی ایجاد می‌کند (ظروف یکسان –دماییکسان) ظروف بایدبادقت شسته وآبکشیده شودتاکوچک‌ترین آثارمیکروارگانیسم روی لوله‌هاباقی نماند. (۳۶)
۲-۵-۳-۳٫روش انتشار(Diffusion methods)
در این روش ماده‌ی مورد آزمایش را روی محیط جامد قرار داده تا به داخل آگار انتشار پیدا کند. اگر ماده‌ی مورد آزمایش از عوامل ضد قارچ باشد، نتیجه به صورت یک هاله‌ی عدم رشد ظاهر می‌شود اندازه‌ی هاله‌ها به غلظت ماده‌ی مورد اندازهگیری و مقدار آن بستگی دارد. بین اندازه‌ی هاله‌ها و لگاریتم غلظت ماده‌ی مورد آزمایش ارتباط خطی وجود دارد. با اندازهگیری فاصله‌ای که ماده‌ی مورد آزمایش انتشار پیدا نمود، به صورت رشد یا عدم رشد میکروب مورد آزمایش و مقایسه‌ی آن با استاندارد مشخص، قدرت نمونه‌ی مورد آزمایش محاسبه می‌شود. (۳۶)
۲-۵-۳-۳-۱٫انتشار عمودی(vertical (liner) diffusion)
در این روش یک حجم از محلول مورد اندازهگیری را در بالای ستونی از محیط کشت جامد حاوی قارچ مورد آزمایش قرار داده و می‌گذارند به طرف پایین انتشار یابد. طول ستونی از محیط کشت را که در آن رشد یا عدم رشد دیده می‌شود دقیقاً اندازهگیری کرده و بامنحنی استاندارد مخصوص مقایسه می‌شود. تنها مزیت این روش آن است که میزان انتشار ماده را در آگار از نظر هندسی بهتر می‌توان کنترل و معین نمود. (۳۶)
۲-۵-۳-۳-۱٫انتشار افقی(Horizontal diffusion)
پنج روش براساس انتشار به صورت افقی وجود دارد که در تمام آن‌ها ماده‌ی مورد آزمایش از قسمت مرکز به اطراف انتشار پیدا نموده و ایجاد هاله‌های رشد یا عدم رشد را می کند. (۳۶)
۱ـ روش سینلدرپلیت(Cylinder plate method)
در این روش سیلندرهای مخصوص را در روی محیط آگار قرار داده و آن‌ها را از محلول ماده‌ی مورد اندازهگیری پر می‌نمایند. جنس سیلندرها پیرکس، چینی لعابدار، آلومیینیوم یا استنلس استیل می‌باشد. (۳۷)
سیلندرها را ممکن است به حالت سرد روی آگار گذارده و یا کمی گرم نموده و سپس روی آگار قرار داد. سیلندرهای گرم شده بهتر در آگار فرو رفته و منفذی بین آگار و سیلندر باقی نمی‌ماند. سیلندرها بایستی به طور یکنواخت در آگار فرو رفته و کنترل عمقی از سیلندر که در آگار قرار می‌گیرد قابل اهمیت است. اگر سیلندرها در آگار عمیقاً فرو روند، اندازه‌ی هاله کوچک‌تر خواهد شد. اگر سیلندرها با عمق‌های مختلف در آگار فرو رفته باشند، باعث خطاهای تجربی بعلت اختلاف اندازه‌ی هاله خواهد گردید. سیلندرها را ممکن است با دست و یا با کمک ماشین‌های خودکار در آگار قرار داد. (۳۶)
سیلندرها را باید از نمونه‌ی آزمایشی کاملاً پرنمود تا از خطا جلوگیری بعمل آید. در موقع حرکت پلیت‌ها باید دقت نمود که سیلندرها از آگار جدا نشده و یا آنکه محلول داخل سیلندرها به خارج ریخته نشود. (۳۹)
۲ـ روش چاهک پلیت (Cup plate method)
اساس این روش نیز بر پایه‌ی انتشار آگار در محیط کشت جامد است. پس از ریختن محیط در پلیت و بسته شدن محیط کشت با یک وسیله‌ی مناسب، جفراتی در آن ایجاد کرده و ته حفرات را با یک قطره از محیط کشت ذوب شده پر کرده تا بسته شوند. داخل حفرات را از ماده‌ی مورد آزمایش پرکرده و پس از مدت لازم، هاله‌های رشد یا عدم رشد ایجاد می‌شود که قطر هاله‌ها اندازهگیری می‌شود. حساسیت این روش مانند روش سیلندر پلیت می‌باشد. (۳۸)
محاسن این روش به قرار زیر می‌باشد:
آسانی حمل و نقل پلیت‌ها به علت نبودن سیلندرها
حساسیت بیشتر در رقت‌های کم در مقایسه با روش دیسک کاغذی
عدم تداخل مواد سوسپانسیون شده با انتشار در داخل آگار
یکنواخت بودن اندازه‌ی چاهک‌ها و عدم اختلاف در اندازه‌ی سیلندرها (۳۹)
معایب آن عبارتند از:
صرف وقت برای کندن چاهک ها
باید در حمل و نقل پلیت‌ها دقت نمود تا محلول به خارج چاهک‌ها نریزد. (۳۹)
۳ـ روش دیسک کاغذیPaper disk method))
دیسک دیفیوژن، روش اندازهگیری حساسیت، به منظور طبقه‌بندی قارچ‌ها به سه دسته حساس، مقاوم و حد واسط نسبت به عوامل مختلف ضد قارچ می‌باشد. این روش اولین بار توسط Kiby, Sherries, Turck, Bauer طراحی شد که در آن از یک دیسک محتوی مقدار زیادی از یک نوع ضد قارچ استفاده می‌شود. (۳۸)
محلول‌هایی را که باید سنجش شوند به کمک پیپت روی دیسک قرار می‌دهند یا اینکه دیسک‌ها را در محلول انداخته و خیس می‌نمایند. دیسک‌ها را ممکن است به حالت تر و یا خشک در روی پلیت قرار داد. هم چنین با این روش می‌توان محلول‌های حاوی حلال‌های آلی را نیز اندازهگیری نمود. دیسک‌ها را با محلول مورد آزمایش تر نموده و سپس حلال را قبل از این که در روی آگار قرار دهیم تبخیر کرده، جهت انجام این تست دیسک‌های کاغذی که محلول مورد آزمایش در آن تلقیح شده است، برروی سطح پلیت مولر هینتون آگار آغشته به باکتری قرار داده می‌شود. ۱۵ دقیقه بعد از دیسک‌گذاری، پلیت‌ها وارونه شده و به مدت یک شب در دمای ۳۵ درجه‌ی سانتی‌گراد در گرم‌خانه قرار می‌گیرند. تأخیر بیشتر از ۱۵ دقیقه قبل از گذاشتن در گرم‌خانه باعث می‌شود نفوذ اولیه‌ی محلول موردآزمایش افزایش یابد. (۳۸ و ۳۹)
اگرپلیت‌ها به طور صحیح انکوبه شوند، قطر هاله‌های عدم رشد به صورت دوایر یکنواخت ایجاد شوند. رشدی که شامل کلونی‌های تک باشد، حاکی از این است که ماده‌ی تلقیحی خیلی کم بوده و تست باید تکرار شود. اگر میکروارگانیسم مورد نظر بتواند به صورت موفقیت‌آمیز در محیط مولر هینتون آگار بعد از یک شب گرم‌خانه گذاری رشد کند، ممکن است به آگار ۵/۰ خون گوسفند فاقد فیبرین اضافه شود که اینکار هیچ اثر محسوسی در نتیجه نهایی نخواهد داشت. (۳۹)
تفسیر نتایج حاصل از روش دیسک‌گذاری بستگی به نحوه‌ی اجرای مناسب آزمایش دارد. عوامل متغیری که از خارج بر روی آزمایش اثر دارند عبارتند از: pH، ارتفاع، مقدار یون مثبت، مکمل‌ها، منبع مولر هینتون آگار، سن و کدورت محلول قارچی، روشی که طی آن محلول قارچ‌ها بر روی پلیت پخش می‌شود، دما، اتمسفر، طول مدت گرم‌خانه گذاری، روش خواندن نتایج،مقدار ماده‌ی ضد قارچی موجود در دیسک، سن و شرایط نگهداری دیسک‌ها و بسیاری از عوامل دیگر.(۳۹)
از معایب روش دیسک کاغذی فقط می‌توان به حساسیت کم‌تر آن نسبت به رقت‌های ضعیف اشاره نمود. (۳۹)
۴ـ روش دیسک براث
این روش متداول‌ترین روش برای آزمایش ضد قارچی است که در آن محیط کشت مایع به جای جامد استفاده می‌شود. (۳۹)
۵ـ روش قطره پلیت(Drop plate method)
این روش با قرار دادن یک قطره از محلول مورد اندازهگیری در روی سطح آگار حاوی میکروارگانیسم انجام می‌شود. این متد از نظر کیفی بیشتر مورد قبول می‌باشد تا از نظر کمی و دارای دقت کافی نبوده و به ندرت مورد استفاده قرار می‌گیرد. (۳۸)
۲-۵-۴ .عوامل مؤثر در اندازهگیری به روش انتشار :
۲-۵-۴-۱٫آگار
اندزه‌گیری به روش انتشار اساساً بستگی به انتشار ماده‌ی مورد اندازهگیری در آگار دارد. به این ترتیب آگار یکی از مهم‌ترین عوامل در این روش می‌باشد. (۳۶)
عمق آگارDepth of agar
آگار را ممکن است در پلیت‌های خیلی نازک تقسیم نمایند. لایه‌های نازک، ایجاد هاله بزرگ‌تری می‌کند. (۳۶)
اکثر محققین لایه‌های با قطر ۵ – ۳ میلی‌متررابرای اندازهگیری مناسب می‌دانند. اگرلایه‌ی‌آگارخیلی نازک ویاخیلی ضخیم باشد،منحنی‌های لگاریتمیک آن بصورت خطی به دست نخواهد آمد. باید توجه نمود که در یک سری آزمایش تمام پلیت‌ها به یک ضخامت پرشده باشند.(۳۹)
۲ـ خشکی آگارDryness of agar
اگر آگار به حد کافی خشک نباشد باعث ایجاد هاله‌هایی با کناره‌های نامشخص می‌گردد. در موقع خشک کردن آگار بایستی توجه نمود که از ورود آلودگی هوا جلوگیری به عمل آید و با برگرداندن پلیت‌ها روی در آن‌ها می‌توان مشکل را برطرف نمود. (۳۹)
۳ـ مقدار آگارAmonunt of agar
عقیده بر این است که حساسیت روش انتشار با کم کردن مقدار آگار در محیط کشت زیادتر می‌گردد. این موضوع هم‌چنین به جنس و منشاء آگار بستگی دارد. (۳۹)
۲-۴-۴-۲٫ pHآگار و محلول مورد اندازهگیری:
تغییرات pHفعالیت و پایداری مواد مورد اندازهگیری مؤثر می‌باشد. منظور از pHآگار این است که در حد مناسب برای رشد میکروارگانیسم‌ها انتخاب گردد؛ از طرف دیگر منظور از pH برای محلول مورد اندازهگیری آن است که مناسب فعالیت و پایداری ماده‌ی مورد آزمایش باشد. اندازه و قطر هاله با تغییر pHآگار و هم چنین با تغییر pHمحلول مورد اندازهگیری تغییر می کند. (۳۹)
۲-۵-۴-۳٫ شرایط کشت در گرم‌خانه
زمان لازم و درجه حرارت برای نگهداری کشت‌ها در گرم‌خانه بر اندازه‌ی هاله‌های به دست آمده اثر می‌گذارد؛ نسبت به نوع قارچ و مواد مورد سنجش متفاوت بوده و تنظیم این دو عامل بستگی به خصوصیات و شرایط لازم در هر اندازهگیری دارد. اگر بخواهیم هاله‌های بزرگ‌تری داشته باشیم باید فاز وقفه (Iag phase) رشدقارچ ها را تغییر داد. این امر بدین ترتیب عملی می‌شود که بعد از قرار دادن نمونه‌ها در پلیت‌ها آن‌ها را مدتی در یخچال و یا در حرارت آزمایشگاه قرار می‌دهند. بدین ترتیب انتشار بهتر انجام شده و هاله‌های بزرگ‌تری ایجاد خواهد شد. (۳۹)
