نمونه­ها به مدت ۱۰ دقیقه در دور × g ۵۰۰۰ سانتریوفوژ شدند. مایع رویی دور ریخته شد باقیمانده آن به میکروتیوب­های ۲ سی­سی انتقال داده شد. از ۲۰۰ میکرولیتر از این مایع با بهره گرفتن از کیت (AccuPrep® Genomic DNA Extraction Kit, Bioneer, Daejeon, South Korea) مطابق با دستور شرکت سازنده استخراج DNA صورت گرفت.
۳-۶- تشخیص حضور E. coli، T. pyogenes، F. necrophorumو P. melaninogenicus با PCR
برای همه این باکتری­ ها یک غلظت از واکنش دهنده­ها آماده شد. ۲۰ میکرولیتر محلول تهیه شد که شامل ۱۰ پیکومول از هر پرایمر (جدول ۱)، ۲۵/۰ میلی مول از هر داکسی­نوکلئوتید تری فسفات، ۷۵/۰ میلی مول کلرید منیزیم، بافر تگ پلیمراز X1، ۱ واحد آنزیم تگ پلیمراز (پارس توس، مشهد، ایران) و ۴ میکرولیتر از DNA نمونه به عنوان الگو. واکنش زنجیره­ای استاندارد برای هر باکتری به صورت جداگانه به شرح زیر انجام شد.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

باکتری E. coli: یک چرخه (۹۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۰ دقیقه)، ۳۰ چرخه (۹۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ دقیقه، ۵۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ دقیقه، ۷۲ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ دقیقه)، یک چرخه (۷۲ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۰ دقیقه) (Bicalho et al. 2012).
باکتری T. pyogenes: یک چرخه (۹۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۰ دقیقه)، ۳۰ چرخه (۹۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ دقیقه، ۵۶ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ دقیقه، ۷۲ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ دقیقه)، یک چرخه (۷۲ درجه سانتی ­گراد به مدت ۵ دقیقه) (Silva et al. 2009).
باکتری F. necrophorum: یک چرخه (۹۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۵ دقیقه)، ۳۰ چرخه (۹۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۵۹ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳۰ ثانیه)، یک چرخه (۷۲ درجه سانتی ­گراد به مدت ۵ دقیقه)
(Bennett et al. 2009).
باکتری P. melaninogenicus: یک چرخه (۹۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۵ دقیقه)، ۲۵ چرخه (۹۵ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱۵ ثانیه، ۵۴ درجه سانتی ­گراد به مدت ۳۰ ثانیه، ۷۲ درجه سانتی ­گراد به مدت ۱ دقیقه)، یک چرخه (۷۲ درجه سانتی ­گراد به مدت ۵ دقیقه) (Yoshida et al. 2005).