۵-پس از ۲۰ دقیقه، ۱ml از باکتری های فوق به عنوان نمونه قبل از القاء برداشت شد و مابقی باکتری با غلظت ۱mM ازIPTG برای بیان پروتئین نوترکیب القاء شد و مجددا در انکوباتور ۳۰ درجه سانتی گراد قرار گرفت.
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۶- حدود ۶ ساعت بعد از القاء، نمونه های بعد از القاء نیز جمع آوری شدند. به نحوی که در هر فالکون ۲۵۰ml کشت باکتری رسوب گیری شد. به این منظور رسوب گیری طی ۵ بار سانتریفوژ برای هر فالکون انجام شد.
*برای برداشت نمونه های مذکور ،رسوب باکتریایی هر یک از کشت ها به مدت ۵ دقیقه در ۶۰۰۰rpm سانتریفوژ گردید.
*این رسوب می تواند پس از خشک شدن در ۲۰- درجه سانتی گراد نگهداری شود و یا مستقیما وارد مراحل تخلیص شود.
۳-۱۴-الکتروفورز پروتئین در ژل آکریل آمید در حضور SDS
SDS-PAGE روشی مناسب و سریع در مطالعه پروتئین ها می باشد و معمولا برای بررسی مراحل خالص سازی ، محاسبه مقدار نسبی و تعیین وزن ملکولی پروتئین ها به کار می رود.
در این روش با بهره گرفتن از ژل پلی آکریل آمید (Polyacrylamide ) که پلی‌مری بی بار و غیر فعال از نظر شیمیایی است و سدیم دودسیل سولفات که دترجنتی آنیونی می باشد، پروتئین‌ها براساس وزن ملکولی خود تفکیک می گردند. با توجه به اندازه منافذ ژل پروتئین های کوچکتر با مزاحمت کمتر و پروتئین های بزرگتر با مشکل بیشتری حرکت می کنند و مسافت طی شده در پایان الکتروفورز با وزن ملکولی آنها تناسب دارد.این مسئله اساس تعیین وزن ملکولی در روش SDS-PAGE را تشکیل می‌دهد. SDS به مناطق آبگریز پروتئین ها متصل می شود و بار طبیعی آنها را می‌پوشاند در نتیجه بار منفی با تراکم مشابه در آنها ایجاد می‌کند. ماده احیا کننده‌ای هم که در بافر نمونه به کار می رود پیوندهای دی سولفیدی را شکسته و پروتئین کاملا باز می شود. بنابراین پروتئین ها بار منفی با تراکم مشابه یافته و در دامنه وسیعی از PH به طرف آند حرکت می کنند.
مواد و وسایل مورد نیاز:
محلول استوک آکریل آمید(۳۰٫۸ درصد)
بالفر ژل پایین
بافر ژل بالا
بافر الکترود
پرسولفات آمونیوم(سیگما) ۱۰ درصد در آب مقطر
بافر نمونه
تمد(سیگما) ۱۰ درصد در آب مقطر
استاندارد وزن ملکولی (Fermentas)
منبع نیرو
تانک الکتروفورز عمودی
صفحات شیشه ای و فاصله اندازه ها
گیره
سرنگ هامیلتون
آب مقطر
روش تهیه محلول ها و بافرها
محلول استوک آکریل آمید(۳۰٫۸ درصد)
۳۰ گرم آکریل آمید و ۰٫۸ گرم بیس آکریل آمید در آب مقطر تا حجم ۱۰۰ میلی لیتر حل و با کاغذ واتمن صاف گردید(نگهداری در ظرف تیره و یخچال)
بافر ژل پایین:
۱۸٫۲ گرم تریس باز و ۰٫۴ گرم SDS در حدود ۷۰ میلی لیتر آب مقطر حل گشته و با اسید کلریدریک به PH 8.8 رسید. سپس به حجم نهایی ۱۰۰ میلی لیتر رسید.
۳- بافر ژل بالا:
۶٫۱ گرم تریس باز و ۰٫۴ گرم SDS در حدود ۵۰ میلی لیتر آب مقطر حل گشته و با اسید کلریدریک به PH 6.8 رسید.سپس به حجم نهایی ۱۰۰ میلی لیتر رسید.
۴- بافر الکترود:
۳ گرم تریس باز ،۱۴٫۴ گرم گلایسین و ۱ گرم SDS در یک لیتر آب مقطر حل گردید.
۵- بافر نمونه(۵X):
۱۰ میلی لیتر بافر ژل بالا ،۵ میلی لیتر گلیسرول،۱ گرم SDS ،۰٫۲ میلی لیتر محلول برموفنل بلو(۰٫۵ درصد در اتانل ) و یک میلی لیتر ۲-مرکاپتواتانل مخلوط شده و با آب مقطر به حجم ۲۰ میلی لیتر رسیدند.
روش انجام SDS-PAGE :
محلول ژل پایین با غلظت ۱۲٫۵ درصد و ژل بالا با غلظت ۵ درصد بر اساس آماده گردید.
پس از آماده نمودن صفحات شیشه ای و ریختن ژل بالا و پایین ،شانه برداشته شده و آنها به تانک الکتروفورز متصل گردیدند و مخازن تا ارتفاع مناسب با بافر الکترود پر شد. نمونه پروتئین که با بافر نمونه ۵ دقیقه در آب جوش قرار گرفته بود، به وسیله سرنگ هامیلتون در چاهک ها ریخته شدند.
الکتروفورز در ولتاژ ثابت ۱۰۰ ولت انجام گرفت. در پایان ژل با دقت از میان صفحات شیشه ای خارج شده و برای مراحل بعدی آماده می گردد.
۳-۱۵- رنگ آمیزی ژل با کوماسی بلوR-350
این روش رنگ آمیزی ، ساده ،ارزان و نسبتا حساس می باشد و رنگ برای مدت های طولانی ثابت می ماند.در این روش مراحل ثبوت و رنگ آمیزی پروتئین ها به صورت همزمان انجام می شود.
مواد و وسایل مورد نیاز:
قرص کوماسی بلو R-350 (فارماسیا)
متانول(مرک)
اسیداستیک(مرک)
ظرف درب دار شیشه ای
آب مقطر
۳-۱۵-۱- روش تهیه محلول ها
محلول رنگ آمیزی:
یک قرص کوماسی بلو در ۸۰ میلی لیتر آب مقطر و ۱۲۰ میلی لیتر متانول حل و به عنوان محلول استوک نگهداری شد. در هنگام استفاده یک حجم محلول استوک با یک حجم محلول اسیداستیک ۲۰ درصد (در آب مقطر) مخلوط گشت. قبل از استفاده با کاغذ واتمن صاف گردید.
محلول رنگ بر:
با ترکیب ۲۰۰ میلی لیتر متانول ،۱۰۰ میلی لیتر اسیداستیک گلایسیال و ۷۰۰ میلی لیتر آب مقطر تهیه گردید.
