۸/۵-۷/۵

pH

۳-۲- انتقال توسط اگروباکتریوم

۳-۲-۱- مواد

ترکیب بافرها و محیط کشت مورد استفاده در این بررسی به صورت زیر آورده شده است. موادی که برای تهیه بافرها و محیط کشت استفاده شد دارای درجه بالای خلوص و مناسب آزمایش های زیست شناسی مولکولی بوده و از شرکت­های Merk، Sinagene و Metabion تهیه شده بود. در تمام موارد از آب یون برداری شده و گندزدایی شده استفاده شد.
(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت nefo.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

۳-۲-۱-۱- بافر STET

این بافر با ۸% سوکروز، ۵% تریتون X100، اتیلن دی آمین تترا استیک اسید دی سدیم۵۰ میلی مولار با ۸ =pH و تریس-HCL با ۸ =pH تهیه شد.

۳-۲-۱-۲- بافر الکتروفورز

از بافر TBE برای الکتروفورز استفاده شد که با تریس بورات ۸۹ میلی مولار با ۳/۸=pH و اتیلن دی آمین تترا استیک اسید دی سدیم ۲ میلی مولار تهیه شد.

۳-۲-۱-۳- بافر CTAB

این بافر با CTAB 5/2 درصد، NaCl 4/1 مولار، اتیلن دی آمین تترا استیک اسید دی سدیم ۲۰ میلی مولار با ۸ =pH، تریس-HCl 100 میلی مولار با ۸ =pH و ۲- مرکاپتو اتانول ۲% تهیه شد.

۳-۲-۱-۴- بافر TE

این بافر از اتیلن دی آمین تترا استیک اسید دی سدیم ۱ میلی مولار و تریس-HCl 10 میلی مولار با ۸=pH تهیه شد.

۳-۲-۱- ۵- بافر سنجش GUS

این بافر دارای ۲۰ میلی گرم در میلی لیتر X-gluc، بافر فسفات ۱۰۰ میلی مولار، فروسیانید پتاسیم ۵/۰ میلی مولار، فریسیانید پتاسیم ۵/۰ میلی مولار، ۱/۰% تریتون X100 و ۲۰% متانول با ۸ =pH است.

۳-۲-۱-۶- بافر بارگذاری^[۴۹]

ترکیب بافر بارگذاری شامل برومو فنول بلو ۲۵/۰ درصد(w/v) و گلیسرول ۳۰ % بود.

۳-۲-۱-۷- محلول ذخیره آنتی بیوتیک کانامیسین

محلول ذخیره کانامیسین به صورت ۵۰ میلی گرم در میلی لیتر تهیه شد. پودر آن در آب حل گردید و در دمای ۲۰- درجه سلسیوس نگهداری شد.

۳-۲-۱-۸- محلول ذخیره آنتی بیوتیک ریفامپیسین

محلول ذخیره ریفامپیسین به صورت ۲۵ میلی گرم در میلی لیتر تهیه شد. پودر آن در متانول حل گردید و در دمای ۲۰- درجه سلسیوس نگهداری شد.

۳-۲-۱-۹- محلول ذخیره آنتی بیوتیک سفاتاکسیم

محلول ذخیره ی سفاتاکسیم به صورت ۲۵۰ میلی گرم در میلی لیتر تهیه شد. برای این منظور ۱ گرم پودر سفاتاکسیم به همراه چند قطره متانول با آب مقطر دوبار تقطیر شده به حجم ۴ میلی لیتر رسید و در دمای ۲۰- درجه سلسیوس نگه داری شد.

۳-۲-۱-۱۰- محلول ذخیره استوسیرینگون

محلول ذخیره استوسیرینگون به صورت ۶۲/۱۹ میلی گرم در میلی لیتر تهیه شد. برای این منظور ۲/۱۹۶ میلی گرم از پودر استوسیرینگون در ۱ میلی لیتر اتانول حل و با آب مقطر دوبار تقطیر شده به حجم ۱۰ میلی لیتر رسانده شد و در دمای ۲۰- درجه سلسیوس نگه داری شد.

۳-۲-۱-۱۱- محلول ذخیره نفتالن استیک اسید

محلول ذخیره نفتالن استیک اسید به صورت ۱۰۰ میلی گرم در لیتر تهیه شد. برای این منظور ۱۰ میلی گرم از پودر نفتالن استیک اسید در چند قطره ۱N NaOH حل و سپس با آب مقطر دوبار تقطیر شده به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانیده شده و در دمای ۲۰- درجه سلسیوس نگه داری شد.

۳-۲-۱-۱۲- محلول ذخیره بنزیل آدنین

محلول ذخیره بنزیل آدنین به صورت ۱۰۰ میلی گرم در لیتر تهیه شد. برای این منظور ۱۰ میلی گرم از پودر این ترکیب در چند قطره ۱N NaOH حل و سپس با آب مقطر دوبار تقطیر شده به حجم ۱۰۰ میلی لیتر رسانیده شده و در دمای ۲۰- درجه سلسیوس نگه داری شد.

۳-۲-۱-۱۳- محیط کشت LB (Luria-Bertani)

این محیط کشت با ۱% (۱۰ گرم در لیتر) تریپتون، ۵/۰% (۵ گرم در لیتر) عصاره ی مخمر و ۱% (۱۰ گرم در لیتر) NaCl تهیه شد. برای تهیه محیط کشت جامد ۲/۱% آگار به آن افزوده شد.

۳-۲-۱-۱۴- سویه A. tumefaciens

در آزمایش ها از A. tumefaciens strain LBA 4404 حامل پلاسمید دوگانه به عنوان یک سیستم ناقل برای انتقال ژن به ریزنمونه های گیاهی استفاده شد. T-DNA پلاسمید دوگانه افزون بر سازه بیان ژن مورد نظر دارای یک ژن نشانگر گزینشگر، برای مثال nptII، و یک ژن نشانگر گزارشگر، uidA، هر دو دارای توالی های آغاز کننده و پایان دهنده، می باشد. پلاسمید دوگانه با روش انجماد و ذوب وارد اگروباکتریوم شد.

۳-۳- روش ها

۳-۳-۱- تهیه ریزنمونه

در آزمایش ها از قطعه­های برگ یا گلبرگ و پینه به عنوان ریزنمونه استفاده شد.

۳-۳-۲- تهیه محیط های کشت بافت گیاهی

فهرستی از محیط های کشت بافت گیاهی که در آزمایش ها از آن ها استفاده شد در جدول ۲-۳ آورده شده است. تمام محیط های کشت در دمای ۱۲۱ درجه سلسیوس و فشار ۵/۱ کیلوگرم بر سانتی متر مربع به مدت ۲۰ دقیقه سترون شدند.
جدول ۲-۳- انواع محیط های کشت مورد استفاده.