می کند. برای اطمینان از تکثیر موفق هر واکنش حاوی یک جفت پرایمر به عنوان کنترل داخلی است.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

جدول ۳-۶ :طراحی پرایمرARMS PCR برای پلی مورفیسم rs113488022ژن BRAF

۳-۳-۳-۲-۲آماده سازی پرایمرها
پرایمر های مورد نظر از شرکت زیماژن سفارش داده شد . پرایمر های به صورت لیوفلیزه بوده و مشخصات کامل آن ها شامل OD ، دمای Tm، وزن مولکولی ، طول و طراحی پرایمر، تعداد نوکلئوتید های هر پرایمر، درصد GC و رقت هر کدام از پرایمر ها، همگی در دستور کار آن موجود بود.طبق دستورالعمل شرکت که به همراه پرایمر ها ارسال شده است، باید به کرایور های حاوی پرایمر های لیوفلیزه آب مقطر دیونیزه اضافه کرد و آن را خوب پپیتاژ کرده تا محلول پرایمر مایع یکدست با غلظت ۱۰۰Um فراهم گردد.محلول بدست آمده به عنوان محلول اصلی (Stock)در فریزر ۸۰- درجه سانتی گراد قرار می گیرد.
از محلول اصلی ، محلول کار (Working)با غلظت ۱۰ تهیه کرده و به منظور PCR مورد استفاده قرار
می گیرد.
۳-۳-۳-۲-۳روش انجام ARMS PCR
چندشکلی های تک نوکلئوتیدی جایگاه های بازی در ژنوم می باشند که تغییرات طبیعی در جمعیت نشان می دهند. SNPها بیشترین شکل تغییر ژنتیکی را در انسان ها نشان می دهند که شامل بیش از ۹۰% تمام تفاوت های بین افراد غیرخویشاوند می باشد.الگوهای ژنوتیپی مربوط به SNPها احتمالاً روی بسیاری از فنوتیپ های انسانی می گذارند. بنابراین، مطالعات بررسی پیوستگی ژنوتیپ های SNPها با شکل خاصی از فنوتیپ بیماری در مقیاس بالاانتظار می رود که به شناسایی ژن های درگیر در بیماری های پیچیده، ژن های پاسخ به داروها و مواد شیمیایی کمک نماید.
چندشکلی های تک نوکلئوتیدی (Single nucleotide polymorphism “SNPs”) موجود در ژنوم انسان، مارکرهای مهمی جهت درک ساختار، الگوی بیان و عملکردهای ژن های طبیعی می باشندو همچنین در تشخیص پیش از تولد، پیش از علامت دار شدن بیماری و مشاوره ژنتیک بسیار حائز اهمیت می باشند.
در حال حاضر، تکنیک های زیادی جهت تشخیص سریع SNPها توصیف شده اند که انتخاب یکی از آنها در هر مورد خاص بسیار مورد بحث می باشد. فاکتورهای متعددی جهت انتخاب مناسب ترین و کاربردی ترین روش در هر مورد باید موردتوجه قرار گیرد که از آن جمله می توان به سادگی کاربرد تست، مقرون به صرفه بودن از نظر هزینه، دقت بالا در محدوده ۹/۹۹% و تکرارپذیری تست اشاره نمود.
روش ARMS-PCR (amplification refractory mutation system) اولین بار توسط Newton و همکاران در سال ۱۹۸۹ بعنوان یک تکنیک عمومی جهت تشخیص جهش نقطه ای یا حذف و اینزرشن های کوچک معرفی گردید.این روش با نام های دیگر از جمله allele- specific PCR (ASPCR)، allele-specific amplification (ASA) نیز شناسایی می شود.
روش ARMS استاندارد که قابلیت تشخیص چندشکلی های تک نوکلئوتیدی شناخته شده را دارد، شامل دو واکنش PCR همزمان می باشد: یک واکنش شامل پرایمر اختصاصی برای توالی DNA نرمال که نمی تواند DNA موتانت را تکثیر نماید و واکنش دیگر که حاوی پرایمر اختصاصی مکمل توالی مربوط به آلل موتانت است و قادر به تکثیر DNA طبیعی نمی باشد.ژنوتیپ افراد با آنالیز محصولات تکثیر شده قابل تعیین
می باشد.برای فرد هموزیگوت تکثیر تنها در یکی از واکنش ها صورت می گیرد و برای ژنوتیپ هتروزیگوت محصولات PCR در هر دو واکنش بدست می آیند.بنابراین می توان گفت در این روش تولید یا عدم تولید محصول PCR بعنوان معیار تشخیصی جهت بررسی حضور یا عدم حضور آلل موردنظر استفاده می شود.
روش ARMS دارای چندین مزیت نسبت به سایر روش های تشخیصی مبتنی بر PCR مانند PCR-RFLP می باشد. این روش سریع، قابل اعتماد، ارزان و با قابلیت تکرارپذیری بالا می باشد و با یک روز کار امکان دستیابی به نتیجه وجود دارد.
آگارز در واقع پلیمر پلی‌ساکاریدی متشکل از واحدهای متناوب ۳ , ۶- anhydro L- galactose و D- galactose با اتصالات گلیکوزیدی )  ( و )  ( می باشد، که از نوعی جلبک قرمز دریایی استخراج می‌شود.ترکیب خالص این ماده پودر سفید رنگ بی بو و بی مزه ای است که قابلیت جذب آب فراوان دارد.این ترکیب در آب سرد نامحلول بوده ترکیب کلوئیدی ایجاد می کند.افزایش دمای این محلول کلوئیدی نهایتاً موجب انحلال کامل آگارز می شود، سرد شدن مجدد مجموعه، با ایجاد باندهای هیدروژنی بین زنجیره‌های پلیمری شبکه‌ای با چگالی بسیار بالا ایجاد خواهدکرد.همانطور که پیشتر ذکر شد چنین بستری زمینه انتخابی برای جداسازی ملکول های اسید نوکلئیکی بزرگتر از چند صد باز را به راحتی فراهم می نماید.حرکت مولکول‌های اسیدنوکلئیکی قرار گرفته در چنین ساختاری از طریق منافذ ایجاد شده در آن است، بنابراین مولکول‌های کوچک‌تر راحت‌تر و سریع‌تر از لابه لای منافذ عبور کرده و در بستر ژل حرکت می کنند.تفاوت در سرعت حرکت ملکول های اسیدنوکلئیکی قرار گرفته در زمینه ژل که به سبب تفاوت موجود در اندازه آنها ایجاد شده، نهایتاً موجب جداسازی آنها از هم می گردد.در این تکنیک می توان با بکار بردن یک نشانگر با