ترکیبات

مقادیر (lμ)

محصول PCR
TA vector
PEG 4000 50%
بافر x10
T4 DNA Ligase (5 IU/µl)
آب مقطر
حجم نهایی

۴
۲
۲
۲
۲
تا حجم نهایی
۲۰

ویال موردنظر به مدت یک ساعت در دمایºC 22 انکوبه شد. مقدار پلاسمید مورد استفاده بسته به غلظت آن متغیر است ولی مقدار بهینه حدود ng/ml20 تا ng/ml 100 می‌باشد. نسبت DNA به پلاسمید نیز باید ۱:۱ تا ۵:۱ باشد. پس از اتمام زمان انکوباسیون، پلاسمید برای انجام ترانسفورماسیون به روش شوک حرارتی مورد استفاده قرار گرفت.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

۳-۵-۱-۹-ترانسفورم کردن شیمیایی E. COLI با پلاسمید نوترکیب
فرایند ترانسفورماسیون به روش شوک حرارتی طبق مراحل زیر انجام شد. ابتدا µl 5 از TA vector حاصل از مرحله قبل به µl50 از سلول‌های مستعد E.coli XL1- Blue اضافه شد و به مدت ۳۰ دقیقه درون ظرف یخ در یخچال انکوبه شد. سپس به مدت ۵ دقیقه در ºC42 و ۲ دقیقه در یخ انکوبه شد و پس از آن µl 100 از محیط LB مایع بدون آمپی سیلین به ویال اضافه شد و ۴۵ دقیقه در انکوباتور ºC37 انکوبه شد. در این فاصله به ازای هر ویال، دو پلیت LB حاوی µg/ml 100 آمپی سیلین mM IPTG 10 و X-gal µg/ml 50 تهیه شد. پس از پایان مدت انکوباسیون، محتوای هر ویال روی دو پلیت پورپلیت شده و پلیت‌ها ۱۲ تا ۱۶ ساعت در انکوباتور ºC37 گرماگذاری شدند. پس از اتمام زمان انکوباسیون، تا زمان انتخاب کلنی‌های مثبت، پلیت‌ها در یخچال نگهداری شدند (Kamoun, 2006).
۳-۵-۱-۱۰-غربالگری کلون‌های باکتریایی نوترکیب
ابتدا از هر نمونه ده کلنی سفید با فیلدوپلاتین برداشته شد و در ویال‌های ml 5/1 حاوی ml 1 محیط LB مایع و µg/ml 100 آمپی سیلین کشت داده شدند و ۴ تا ۵ ساعت در انکوباتور ºC37 گرماگذاری شدند. محیط کشت همراه با آنتی بیوتیک بدون تلقیح نیز به‌عنوان شاهد استفاده شد. پس از رسیدن به رشدی معادل ۰٫۵ OD₆₀₀، ویال‌ها شماره گذاری شده و در شرایط کاملا استریل، µl200 از محیط کشت برداشته شد تا برای استخراج DNA به روش boiling استفاده شوند و به µl 800 باقی مانده، µl150 گلیسرول استریل افزوده شد و به فریزر ºC70- منتقل شدند.
برای استخراج DNA، ابتدا ویال‌ها در دور rpm6000 به مدت ۲ دقیقه سانتریفوژ شدند و مایع رویی دور ریخته شد. سپس به منظور شستشوی زیست توده و حذف محیط کشت باقی مانده، به هر ویال µl100 سرم فیزیولوژی اضافه شد و سانتریفوژ با شرایط قبلی تکرار شد. پس از دور‌ریختن مایع رویی، سلول‌ها در µl30 آب دیونیزه حل شده و ۱۵ دقیقه در دمای ºC 95 در دستگاه ترموبلاک، گرماگذاری شدند. پس از پایان ۱۵ دقیقه و تکرار سانتریفوژ با شرایط قبلی، مایع رویی به‌عنوان DNA الگو برای واکنش PCR مورد استفاده قرار گرفت (Kieser, 2000).
به منظور غربالگری پلاسمیدهای حاوی ژن کلون شده، واکنش PCR با بهره گرفتن از پرایمرهای اختصاصی پلاسمید TA vector که قادر به ساخت قطعه ای با طول ۱۰۰۰ نوکلئوتید از توالی پلاسمید می‌باشد، انجام شد. پرایمرهای مورد استفاده، پرایمرهای M13Fو M13R بودند که توالی آن‌ها در جدول ۳-۹ آورده شده است. اجزا و غلظت واکنش‌گرهای مورد استفاده در PCR در جدول ۳-۱۰ آورده شده است.
جدول ۳-۹) نام و توالی پرایمرهای مورد استفاده برای انتخاب کلنی‌های مثبت (مقیمی, ۱۳۹۱)

توالی پرایمر

نام پرایمر

۵’ ACGGTTCCTGGCCTTTTGC ‘3
۵’ CACATTTCCCCGAAAAGTGC ‘3

M13F
M13R

جدول ۳-۱۰) ترکیبات و مقادیر مورد نیاز برای انجام واکنش PCR کلنی­ها (مقیمی, ۱۳۹۱)

ترکیبات

مقادیر (lμ)