بافر لیز کننده: از این بافر به منظور تجزیه سلولی دیواره هست و آزاد سازی محتویات آن استفاده شده است. ترکیبات تشکیل دهنده این بافر در جدول ۳-۳ آورده شد..
جدول ۳-۳- مواد تشکیل دهنده بافر لیز کننده

غلظت مواد

مواد استفاده شده

۱۵ میلی مولار
۴۰۰ میلی مولار
۲ میلی مولار

تریس HCl
کلرید سدیم
EDTA

بافرهای ذکر شده پس از تهیه، برای استریلیزه شدن به مدت ۱۵ دقیقه در دستگاه اتوکلاو در دمای ۱۱۵ درجهسانتی‌گراد با فشار یک اتمسفر قرار داده شدند.

( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )

محلول استات سدیم ۲/۳ مولار: این محلول سبب یونیزه شدن DNAمی‌شود، به طوری‌که تمایل DNA را برای حل شدن در محیط غیر آبی کاهش می‌دهد. این محلول باعث تغلیظ DNAمی‌شود.
SDS10 درصد: باعث حل شدن چربی‌های موجود در غشای سلول می‌شود. این محلول قابل اتوکلاو شدن نیست.
محلول کلرید سدیم ۶/۵ مولار: پس از استفاده از آنزیم پروتئیناز K از این محلول برای حذف آلودگی پروتئین استفاده می‌شود.
اتانــول ۷۰ درصد: از اتانول مطلق تهیه می‌شود که برای شستشوی DNA مورد استفـــاده قرار می‌گیرد. این محلول باعث حذف نمک باقی‌مانده از مراحل استخراج می‌شود.
کلروفرم: برای حذف پروتئین‌های باقی‌مانده استفاده می‌شود.
پس از تهیه محلول‌ها و بافرهای یاد شده، تمام وسایل مورد نیاز برای استخراج DNAاستریل شدند.
۳-۳-۲- مراحل استخراج DNA از نمونه‌های خون
- پس از یخ گشایی، مقدار ۵/۱ سی سی از خون کامل در داخل لوله‌های آزمایش استریل ریخته شد.
- دو برابر حجم خون، بافر جدا کننده اضافه و کاملاً ورتکس شد.
- محلول فوق به مدت ۶ دقیقه با سرعت ۶۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شد.
- پس از سانتریفیوژ، مایع بالایی با خم کردن لوله تخلیه و رسوب حاصله نگهداری شد.
- از مرحله ۲ تا ۴ تا رسیدن به یک رسوب سفید و عاری از لکه‌های خونی، تکرار شد.
- هم حجم اولیه خون (۵/۱ میلی لیتر) از بافر لیز کننده به رسوب داخل لوله آزمایش اضافه و به خوبی ورتکس گردید، تا زمانی که رسوب تشکیل شده کاملاً باز شد.
- مقدار ۴ میـــکرولیتر از آنزیم پروتئیناز K و ۷۰ میکرولیتر از SDS 10 در صد به محـــلول فوق اضافه شده و چند ثانیه ورتکس شد.
- در این مرحله لوله‌های آزمایش به مدت سه ساعت در دمای ۵۵ درجه سانتی‌گراد یا به مدت ۱۲ ساعت در دمای ۳۷ درجه سانتی‌گراد در بن ماری تیمار شدند.
- پس از خروج لوله‌ها از بن ماری، مقدار ۱۷۰۰ میکرو لیتر کلرید سدیم ۶/۵ مولار به لوله‌های آزمایش اضافه شده، سپس به مدت ۱۵ ثانیه با دست به شدت تکان داده شد.
- لوله‌های آزماش به مدت ۲۰ دقیقه با سرعت ۳۰۰۰ دور در دقیقه سانتریفیوژ شدند. در این زمان در لوله آزمایش دو لایه به وجود می‌آید، لایه بالایی دارای DNA است که به کمک سمپلر به درون لوله آزمایش دیگری انتقال داده شد.
- هم حجم مایعی که انتقال داده شده است، کلروفرم اضافه و به آرامی چند بار تکان داده شد و به مدت ۱۰ دقیقه با دور ۳۰۰۰ دور در دقیقه، سانتریفیوژ شد.
- در این مرحله دو فاز ایجاد می‌شود که فاز بالایی حاوی DNA است. با بهره گرفتن از سمپلر فاز بالایی برداشته شد و به لوله آزمایش دیگری انتقال داده شد. در این مرحله برای متراکم کردن DNA، به مقدار ۱/۰ حجم محلول، استات سدیم ۲/۳ مولار اضافه شد.
- دو برابر حجم محلول، اتانول مطلق کاملا سرد اضافه شد. اتانول مطلق برای آبگیری DNA و غلیظ‌تر شدن آن اضافه می‌شود. پس از اضافه کردن اتانول مطلق، لوله آزمایش به آرامی با دست تکان داده شد تا زمانی که کلاف DNA ظاهر شود.
۳-۳-۳- ذخیرهDNA
بعد از این‌که کلافDNAتشکیل شد با بهره گرفتن از لوله‌های شیشه‌ای استریل (پیپت پاستور) به دقت برداشته شده و به داخل تیوب‌های استریل با حجم ۵/۱ میلی لیتر انتقال داده شد. در داخل تیوب استریل با توجه به کلاف مورد نظر مقدار ۲۵۰-۱۵۰ میکرو لیتر از آب مقطر دو بار تقطیر دیونیزه برای حل شدن و نگهداری DNA ریخته شد. برای اینکه کلافDNA بهتر حل شود، تیوب استریل به مدت ۳۰-۱۵ دقیقه در دمای ۵۵ درجه سانتیگراد در بن ماری قرار داده شد. پس از اینکه DNA کاملاً در بافر حل شد، تیوپ‌های دارای DNA در دمای ۲۰- درجه سانتی‌گراد ذخیره شدند.
۳-۳-۴- تعیین ویژگی‌های کیفی DNA
برای تعیین کیفیت DNA استخراج شده از روش الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد.
۳-۳-۴-۱- تعیین کمیت و کیفیتDNA به وسیله الکتروفورز ژل آگارز
در ابتدا محلول TBE(10X) با بهره گرفتن از مواد موجود درجدول ۳-۴ تهیه شده و در ظرفی دربسته درون یخچال نگهداری شد تا هنگام استفاده برای تهیه TBE(1X) مورد نیاز در تهیه ژل آگارز و تانک الکتروفورز رقیق سازی شود.
جدول ۴-۴- مواد محلول TBE(10X)