Actin R

CAAACACTGTACTTTCTCTCCG-3′ 5′-

۳-۷- استخراج دی‏ان‏ا از نمونه‌ی‌ گیاهی با بهره گرفتن از روش CTAB^[16] تغییریافته‌
۳-۷-۱-تهیه‌ی محلول استخراج
برای تهیه‌ی محلول استخراج به میزان ۲۲۰ میلی‌لیتر، کلیه‌ی مواد جدول ۳-۴ در یک بشر ریخته شده و برای مدت کمتر از یک دقیقه در مایکروویو^[۱۷] قرار داده شدند پس از رسیدن دما به ۷۰ درجه سانتیگراد، به میزان ٢/٢ گرم، هگزا دسیل تری متیل آمونیوم بروماید^[۱۸] به آن اضافه و کاملا حل شد سپس بشر برای چند دقیقه در دمای آزمایشگاه قرار داده شد تا سرد شود سپس ٢/٢ میلی‌لیتر مرکاپتواتانول باکتریایی^[۱۹] به آن اضافه شد و در دمای اتاق نگهداری شد.

(( اینجا فقط تکه ای از متن درج شده است. برای خرید متن کامل فایل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. ))

جدول ۳-۴- تهیه‌ی محلول استخراج دی‌ان‌ا.

میزان مورد نیاز

مواد

۱۴۳ میلی‌لیتر

آب دِیونیزه

۲۲ میلی‌لیتر

تریس ۱ مولار ۵/۷ pH

۲۲ میلی‌لیتر

pH 5/0 مولار ۸ EDTA

۸/۳۰ میلی‌لیتر

کلرید سدیم ۵ مولار

۳-۷-۲- روش کار
۱- برگ‏های تازه برداشت شده در نیتروژن مایع منجمد و تا زمان استفاده در ۸٠- درجه سانتی‌گراد نگهداری شد.
۲- حدود ml ۴٠٠ برگ‏ منجمد شده با نیتروژن مایع ساییده شد.
۳- بافت گیاهی پودر شده‌‌‌ی منجمد از هاون چینی به لوله‌ی ml 50 (روی یخ) انتقال داده شد.
۴- میزان ml 9 بافر استخراج ° C65 به آن اضافه و لوله در دمای ۶۵ درجه سانتی‌گراد به مدت یک ساعت تکان داده شد.
۵- لوله‌ها به مدت ۱۰ دقیقه در دمای اتاق قرار داده شدند.
۶- به نسبت ۱‌:‌۲۴ به هر لوله اکتانول:کلروفرم اضافه شد.
۷- لوله‌ها در دمای اتاق به مدت ۱۰ دقیقه تکان داده شدند.
۸- لوله‌‌ها با سرعتg 1420 به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شدند.
۹- با بهره گرفتن از میکروپیپت محلول رویی به یک لوله‌ی جدید ml 15 منتقل شد.
۱۰- اکتانول:کلروفرم به نسبت ۱‌:‌۲۴ به هر لوله اضافه شد.
۱۱- لوله‌ها در دمای اتاق به مدت ۱۰ دقیقه تکان داده شدند.
۱۲- لوله‌ها با سرعتg 1420 به مدت ۱۵ دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شدند.
۱۳- با بهره گرفتن از میکروپیپت محلول رویی به یک لوله‌ی جدید ml 50 منتقل شد.
۱۴- به میزان lµ ۱۰ از RNAase به هر لوله اضافه شد.
۱۵- لوله‌ها به مدت یک ساعت در دمای اتاق قرار گرفتند.
۱۶- ۱۲ میلی‌لیتر اتانول مطلق سرد به هر لوله اضافه شد.
۱۷- لوله‌ها به آرامی تکان داده شدند.
۱۸- دی‌ان‌ا با بهره گرفتن از پیپت‌ پاستور خارج شد و به تیوب ۵/۱ میلی‌لیتری منتقل شد یا با سرعت rpm ٣۴۴٠ به مدت ١٠ دقیقه در دمای اتاق سانتریفیوژ شده و رسوب داده شد.
۱۹- محلول شستشوی شماره‌ی یک، جدول (۳-۵) به دی‌ان‌ا افزوده شد و در این محلول برای مدت ٢٠ دقیقه قرار داده شد.