۵ – ۵
۲- ۱۳-روش های اصلاحی در کلزا
ارقام و واریتههای اصلاح شده گیاهان زراعی و زینتی هر ساله از کشوری به کشور دیگر میشوند. بدین طریق کیفیت و کمیت محصولات کشاورزی افزایش یافته و احتیاجات فراوردههای زراعی رفع میشود. در اغلب گیاهان ژن های با ارزش و اقتصادی فراوان وجود دارد. ژنهایی که حساسیت و مقاومت گیاهان را نسبت به امراض و آفات کنترل میکنند در اولویت برنامههای اصلاح نباتات قرار دارند. هدف اصلاحی نهایی در هر برنامه اصلاحی افزایش عملکرد میباشد. کیفیت مجموع خصوصیاتی است که باعث افزایش ارزش محصول میشود. بهبود کیفیت نیز جزء مهمی از هر برنامه اصلاحنباتات محسوب میشود. افزایش تولید در واحد سطح و استفاده از ژنوتیپهای مفید و مطلوب در هر منطقه آب و هوایی از دیگر اهداف اصلاحگران نباتات میباشد. عملکرد گیاه در واحد سطح منعکس کننده برآیند همه اجزای گیاه میباشد. به هرحال همه ژنوتیپهای تولید شده دارای عکس العمل فیزیولوژیکی و ژنتیکی یکسانی در شرایط مختلف نیستند. عملکرد صفتی پیچیده است که تحت تأثیر ژنوتیپ، محیط و اثر متقابل ژنوتیپ و محیط میباشد [۵].
روش های متداول (کلاسیک) اصلاحنباتات از دیر باز برای تولید ارقام مطلوب در گیاهان زراعی مورد استفاده قرار میگرفته است. این روشها مبتنی بر ایجاد تغییر در ساختار ژنتیکی گیاه کامل با بهره گرفتن از تلاقیهای بین گونه ای و درون گونه ای بوده است. روش های متداول اصلاح نباتات در چند دهه اخیر نقش بسیار مهمی در اصلاح عملکرد و کیفیت کلزا داشته اند، که از میان این روشها میتوان به روش هیبریداسیون و گزینش شجرهای اشاره کرد [۴۱، ۹۰]. در روش های اصلاحی جدید به جز دابلهاپلوییدی که توانایی تولید گیاه کاملاً خالص را دارد، بقیه روشها صرفاً برای ایجاد تنوع به کار میروند و قادر به تولید گیاه کاملاً خالص ژنتیکی نیستند [۹۷]. کلزا با اینکه گیاهی خودگشن و جزئی دگرگشن است، روش های اصلاحی گیاهان خودگشن در آن به کار میرود، ضمن اینکه امروزه به جز ایجاد ارقام هیبرید سایر روش های اصلاحی گیاهان دگرگشن در کلزا متداول شده است. اصلاحگران از جهشزایی به طور موفقیتآمیزی در گیاه کلزا جهت تغییر ساختار ژنتیکی وایجاد تنوع برای صفاتی مانند ارتفاع، تعداد غلاف در گیاه، تعداد دانه در هر غلاف، وزن هزار دانه، عملکرد دانه، محتوی روغن و مقاومت به بیماریها استفاده نموده و لاینهای جهشیافته با صفات اقتصادی مطلوب ایجاد کردهاند [۱۰۱]. از جمله روش های اصلاحی به کار گرفته شده در کلزا میتوان به ۱)تولید ارقام خالص و یا آزاد گرده افشان ۲) تولید ارقام هیبرید ۳) دابلهاپلوییدی و ۴) جهش اشاره کرد.
( اینجا فقط تکه ای از متن فایل پایان نامه درج شده است. برای خرید متن کامل پایان نامه با فرمت ورد می توانید به سایت feko.ir مراجعه نمایید و کلمه کلیدی مورد نظرتان را جستجو نمایید. )
۲-۱۴-جهش
پایداری ساختارهای ژنتیکی موجودات، هیچگاه کامل نیست و این ساختارها ممکن است تحت شرایط فیزیکی یا شیمیای خاص تغییر یابند [۵۳]. تنوع ژنتیکی موجودات کنونی در نتبجه جهشهای بیشماری است که در ریخته ارثی آنان رخ داده است. بسیاری از این جهشها هزاران و یا حتی میلیونها سال پیش رخ داده است. به چنین جهشهایی که بصورت طبیعی در موجودات رخ میدهد، جهشهای خودبخودی گویند در حالی که جهشهایی که توسط بشر و توسط مواد جهشزا ایجاد میشود، جهشهای القایی نام دارند [۶]. مهمترین تفاوت جهشهای خودبخودی با جهشهای القایی، تفاوت در فراوانی وقوع آنها است. بدین ترتیب که فراوانی جهشهای خودبخودی در طبیعت بسیار کمتر است. برخی از گیاهان به طور عمده بوسیله جهش تکامل یافتهاند و برخی جهش به همراه دورگگیری باعث تکامل آنها شده است. موتاسیون یا جهش به صورت تغییر ناگهانی در ماده ارثی یک سلول تعریف میشود. برای اینکه یک جهش قابل شناسایی باشد، باید موجب تغییر در فنوتیپ گیاه گردد. در حال حاضر از جهش به عنوان یک روش اصلاحی در گیاهان استفاده میشود [۳۹، ۴۵].
ازبرنامه های اصلاحی جهش در ایجاد صفاتی نظیر مقاومت به ورس، مقاومت به آفات وامراض، ایجاد زودرسی وتغییر در برخی از خصوصیات دانه از قبیل اندازه، رنگ، درصد پروتئین و روغن، تغییر در اندازه میوه و بالاخره افزایش عملکرد استفاده شده است [۱۰۰، ۱۰۶]. به عنوان مثال در جو برای افزایش اسید آمینه لایسین از این روش استفاده نمودهاند، بنحویکه از واریتهای به نام بومی واریته دیگری به نام بومی-۱۵۰۸ ایجاد نمودند. این رقم جدید حدودا ۴۰ درصد لیزین بیشتری نسبت به واریته قبلی داشته است [۵]. استفاده از جهش در اصلاح گیاهان بویژه در غلات توسعه بیشتری داشته است و در این ارتباط بیشترین تعداد رقم جهش یافته به گیاه برنج تعلق دارد [۳۹]. براساس آمار بانک اطلاعاتی ارقام موتانت، ۳۰۸۸ رقم موتانت متعلق به ۱۷۰۰ گیاه زراعی تاکنون به ثبت رسیده است [۸۸]. رقمهای موتانت در گیاهان دانه روغنی یکساله شامل سویا، کنجد، کلزا، آفتابگردان و بزرک آزاد شدهاند [۲۳]. برای ایجاد جهش در آزمایشهای بهنژادی بهطور معمول بذر مورد تیمار قرار میگیرد. مواد جهشزا به دو گروه شیمیایی و فیزیکی تقسیم میشوند [۹۶].
۲-۱۴-۱- جهشزاهای شیمیایی
موتاژنهای شیمیایی موادی هستند که برخلاف اشعهها موجب ایجاد جهشهای نقطهای میگردند یعنی روی تک نوکلئوتیدها اثر دارند [۳۵، ۳۹]. از معروفترین جهشزاهای شیمیایی میتوان از موارد زیر نام برد:
-آنالوگهای بازی: از معروفترین آنالوگهای بازی می توان از ۵-برومودزکسیاوریدین (۵-BU) نام برد. این ماده باعث جایگزینی بازهای پورین با پیریمیدین میشود. از دیگر آنالوگهای بازی می توان به اسید نیتروس(HNO2)، برومواوراسیل، مالیکهیدرازید(MH) و سدیمآزاید (NaN3) نام برد [۳۸]. هر یک از این مواد شیمیایی با گذشت زمان بدلیل احتمال ثابت ایجاد خطای جفت شدگی بازی، موجب جهش میشوند. پس از ایجاد جهش نیز یک دوره همانندسازی دیگر لازم است تا جهش ثابت شودو هر دو رشته DNA حاوی اطلاعات جهش شوند [۴۸].
-مواد آلکیلاتکننده: این گروه از مواد تولید گروه های آلکیلی میکنند که به گروه های فسفات و بازهای پورین و پیریمیدین متصل شده و موجب آلکیلگذاری DNA میشوند. این مواد باز گوانین را نسبت به بازهای آدنین و سیتوزین بیشتر آلکیله میکند. نقاط اصلی مورد هجوم مواد آلکیلگذار در زنجیره (DNA) اتمهای اکسیژن و نیتروژن میباشند. آلکیلها گروهی از هیدروکربنهای خطی با فرمول کلی CnH2n+1 هستند که با حذف یک اتم هیدروژن از آلکانها (CnH2n+2 ) بدست میآیند. الحاق هر یک از گروه های آلکیل به بازهای آلی و حلقوی DNA را آلکیلگذاری گویند [۳۹]. از معروفترین مواد آلکیلاتکننده میتوان به اتیلمتیلسولفانات (EMS)، اتیلاتانسولفانات (EES)، متیلمتانسولفانات (MMS)، دیاتیلسولفات (DES)، اشاره نمود. به عنوان مثال اتیلمتیلسولفانات (EMS) میتواند باعث تبدیل گوانین به۷-Ethyl Guanine شود که این ماده میتواند با تیمین جفت گردد [۴۵].
-آکریدینها: از معروفترین آکریدینها میتوان از پروفلاوین و آکریدین نارنجی نام برد. آکریدینها موجب اضافه یا کم شدن یک یا چند جفت باز در رشته نوکلئوتید میگردند و بدین ترتیب موجب جهشهایی از نوع تغییر در چارچوب میگردند [۱۲۱]. که جزء خطرناکترین جهشها میباشند و موجب تغییر اساسی در توالی اسیدهای آمینه حاصل از کدهای ژنتیکی میشوند. مواد جهشزا را میتوان بر روی تمامی اندامها اثر داد اما مناسبترین اندام بدین منظور بذر است. از مزایای این کار این است که تیمار دادن بذر با مواد شیمیایی راحتتر است و نگهداری و انتقال بذر تیمار شده به مناطق دوردست امکان پذیر است. برخی از مواد جهشزا قادر به ایجاد جهشهایی در گیاه هستند که منجر به بیش از صد درصد تغییر در ریخت ارثی موجود میشود. به چنین موادی اصطلاحا سوپر جهشزا گفته میشود. از جهشزاهای شیمیایی بر روی قلمهها و جوانهها نیز استفاده میشود [۵، ۷۱].
۲-۱۴-۲-جهشزاهای فیزیکی
موتاژنهای فیزیکی را اشعهها تشکیل میدهند. اصلاحگران غالبا از اشعه x، اشعه γ (گاما)، اشعه α (آلفا)، اشعه β (بتا)، اشعه ماورایبنفش و اشعه نوترون به عنوان موتاژن استفاده میکنند [۱۱۶]. تاریخچه استفاده از اشعهها مربوط به سال ۱۹۲۷ و کشف اشعه x می شود که اولین بار دانشمندی به نام مولر از این اشعه بر روی مگس سرکه استفاده نمود و جهشهایی را ایجاد کرد [۹۳]. تمامی اشعههای ذکر شده به جز اشعه ماورایبنفش، یونیزه کننده هستند و موجب ایجاد تغییرات وسیع در موجود میشوند. اشعه UV قدرت نفوذ کمتری داشته و به طور معمول کاربرد کمتری دارد. از این اشعه جهت ایجاد جهش در دانه گرده استفاده میشود. برای ایجاد جهش در ارگانهای داخلی از اشعههای قویتر استفاده میشود [۱۰۱]. اشعه گاما یک پرتو الکترومغناطیسی با طول موج بسیار کوتاه و انرژی بالاست. توانایی نفوذ این اشعه بسیار بیشتر از اشعه بتا و آلفاست. اشعه گاما هنگام عبور از مواد با اتمهای آنها برخورد میکند و باعث جدا شدن الکترونها از اتمها و تولید یون میشود [۹۶]. در میان عوامل جهشزا، پرتوهای یونیزه کننده مثل اشعهگاما در ایجاد تنوع ژنتیکی در گیاهان موفق بودهاند [۷۳]. برای ایجاد جهش در گیاه کامل، بذرها، مریستم و دانه گرده میتوان از اشعه گاما استفاده کرد [۱۰۰].
۲-۱۴-۳- نسلهای جهش
نسلهای حاصل از دورگگیری با F1، F2، ….و Fn نشان داده میشوند. جهت تمایز بین نسلهای حاصل از جهش با نسلهای حاصل از دورگگیری، نسل های جهش را با M1، M2، M3، …وMn نشان داده میشود. نسل M1 گیاهان حاصل از بذور تیمار شده با موتاژن است [۵].
۲-۱۴-۴-موارد استفاده از بهنژادی جهشی
بهنژادی جهشی روشی است که طی آن از طریق جهش و ایجاد تنوع جدید در جمعیت، اقدام به اصلاح جمعیتها و تولید ارقام جدید مینمایند. در بهنژادی جهشی، اغلب ناهنجاریها در نسل اول موتاسیون یا M1 رخ میدهد. در این نسل درصد بالایی از گیاهان عقیم میباشند و در نتیجه به علت عقیم بودن گل و باز بودن بیش از اندازه گل، درصد بالایی از دگرگشنی ممکن است رخ دهد [۶]. بیشترین نتیجهگیری در بهنژادی جهشی حالتی است که بهترین شرایط برای نسل اول موتاسیون ایجاد گردد تا میزان بذر کافی برای نسل دوم موتاسیون (M2) وجود داشته باشد. چون اغلب موتاسیونها، نهفته هستند و در نسل دوم بروز مییابند [۵]. بذوری که تحت پرتوتابی یا تحت تاثیر مواد شیمیایی موتاژن قرار میگیرند، بهمنظور ارزیابیهای دقیق باید در ردیفهای کوچک و با فاصله از یکدیگر کشت شوند. گیاهانی را که از بذور پرتوتابی شده حاصل می شوند گیاهان M1 و زاده های حاصل از آن ها را گیاهان M2 گویند. هنگامی که از جهشزاها برای بهنژادی جهشی استفاده میگردد، باید توجه داشت جهش حاصل غالب بوده است یا مغلوب، زیرا زمان بررسی این دو نوع جهش با هم متفاوت است. اگر جهش غالب باشد در همان نسل M1 گیاهان با صفت جهش یافته مشاهده میشوند و این گیاهان چون هم میتوانند به فرم خالص و هم میتوانند به فرم ناخالص وجود داشته باشند، بنابراین فرم های جهش یافته ناخالص در نسل M2 تفرق پیدا میکنند، در حالیکه اگر جهش مغلوب باشد تنها در نسل M2 به بعد مشاهده میشود و در نسل M1 به صورت مخفی باقی میماند. ضمن اینکه جهشهای مغلوب به فرم هموزیگوت هستند و بنابراین در نسل M2 تفرق نشان نمیدهند [۶]. بطور کلی بهنژادی با جهش دارای کاربردهای عمده زیر میباشد [۵].
۱-)گسترش پایه ژنتیکی از طریق افزایش تنوع ژنتیکی از طریق ایجاد آللهای جدید با جهش
۲-) شناسایی و گزینش لاین موتانت حاوی صفت مورد نظر
۳-) ایجاد ارقام جدید با بهره گرفتن از لاینهای موتانت به عنوان والد در انجام تلاقیها
۴-) انتقال ژن یا قطعهای از کروموزومهای بیگانه به رقم مورد نظر در تلاقیهای بینگونهای و بین جنسی از طریق ایجاد شکستگیهای کروموزومی با جهش
۵-) شکستن پیوستگی یا لینکاژ بین ژنهای پیوسته و افزایش فراوانی نوترکیبی جهت استفاده از ژنهای مورد نظر
۶-) حل مشکل خودناسازگاری و ایجاد پایه های نر عقیم و بازگرداننده باروری جهت تولید بذر هیبرید با ایجاد جهش در ژنهای مربوطه
۷-) کاهش طول دوره اصلاحی بویژه در گیاهان با تکثیر غیرجنسی
۸-) جهشزایی در کشت سلول و بافت به منظور بهرهبرداری از تنوع سوماکلونی و گامتوکلونی
۹-) اصلاح صفات کمی و کیفی نظیر عملکرد، مقاومت به آفات و امراض، کاهش ارتفاع و بهبود پروتئین
در کلزا استفاده از جهش در کنار اصلاح کلاسیک، جهت ایجاد تنوع ژنتیکی مورد نیاز در صفات کمی و کیفی و اصلاح صفات وابسته به عملکرد و ارتقای سطح کیفی روغن توسط اصلاحگران در دهه های اخیر چشمگیر بوده و منجر به ایجاد انواع جدید ارقام روغنی با بهبود کمی و کیفی و افزایش عملکرد گردیده است. از مهمترین روش های به کار برده شده برای ایجاد تنوع ژنتیکی، جهشزایی از طریق پرتو گاما میباشد [۳۱، ۳۸، ۷۳]. اصلاحگران از جهش زایی به طور موفقیتآمیزی در کلزا جهت تغییر در ساختار ژنتیکی و صفاتی مانند ارتفاع، تعداد غلاف درگیاه، تعداد بذر در هر غلاف، وزن هزار دانه، محتوی روغن و مقاومت به بیماریها استفاده نموده و جهش یافتههایی با صفات اقتصادی مطلوب ایجاد کرده اند [۱۵۱، ۱۶۱].
۲-۱۵- اهداف اصلاحی کلزا
هدف اصلی پروژههای بهنژادی مانند سایر گیاهان زراعی افزایش عملکرد و بهبود کیفیت دانه میباشد. به طور کلی اهداف اصلاحی کلزا را میتوان در زمینه های اصلاح برای بهبود کیفیت دانه، روغن، افزایش عملکرد، مقاومتها، اصلاح کیفیت کنجاله و اصلاح خصوصیات زراعی مطلوب بررسی کرد [۶۳].
۲-۱۵-۱- کیفیت دانه
تلاشهایی در جهت انتقال ژنهای کد کننده اسیدهای آمینه ضروری مانند لیزین و متیونین نیز انجام شده است تا کنجاله گیاه کلزا بتواند با پروتئینهای حیوانی و فرآوردههای لبنی رقابت کند [۱۱۳].
۲-۱۵ -۲-اصلاح برای بهبود کیفیت روغن
روغن دانه در خانواده Brassicaceae به طور کلی دارای مقادیر بالایی از اسید اروسیک میباشد. این صفت در B. rapa با یک مکان ژنی و در گونههای B. napus و B. juncea توسط دو مکان ژنی کنترل میشود [۶۷]. روغن دانه در جنس براسیکا که دارای مقادیر کم اسیداروسیک هستند، روغن بسیار مطلوبی جهت مصرف در سالاد میباشد که کیفیت آن با روغن زیتون قابل مقایسه است. امروزه اصلاح کیفیت روغن دانه در جنس براسیکا در جهت مصارف صنعتی نیز مورد توجه است. متخصصان بیوتکنولوژی به دنبال انتقال ژنهایی هستند که باعث افزایش اسید اروسیک، اسید لوریک (جهت مصرف در صنایع تولید مواد پاککننده و مرطوبکننده)، اسید اریسینولئیک (مصرف در فرآوردههای آرایشی و دارویی برای پلیمرها و مواد روانکننده)، پتروسلنیک اسید (کاربرد در مواد پاککننده و پلیمرها) و اسیدهای پرباپوکسی (کاربرد در ساخت رزینها، استرها و رنگهای نقاشی) میشود و در این راه به موفقیتهای چشمگیری دست یافتهاند [۹۲، ۹۵]. ترکیب روغن کلزا با نسبت امگا ۶ به امگا ۳ برابر ۱:۲ در حال حاضر به عنوان ترکیب مناسب برای تغذیه در نظر گرفته میشود [۱۵۰]. روغن کلزا برای سالاد مناسب است اما ارزش تغذیهای آن میتواند با افزایش محتوی اسید لینولئیک تا ۲۶ % بهبود یابد [۱۰]. کاهش اسیدهای چرب اشباع نیز به بهبود کیفیت تغذیهای روغن کلزا کمک مینماید.
۲-۱۵-۳-اصلاح برای کیفیت کنجاله دانه
وجود گلوگوزینولاتها در کنجاله دانههای جنس براسیکا، کیفیت تغذیهای کنجاله را کاهش میدهد. کرالینگ و همکاران [۱۱۴] با دستکاری ژنهایی که آنزیم کربوکسیلاز تریپتوفان را کنترل میکند، موفق به کاهش سطوح گلوکوزینولاتهای ایندولی کنجاله کلزا به میزان ۹۷ % شدند. ژنوتیپ گیاه پایه مادری مقدار گلوکوزینولات دانه را تعیین میکند و این صفت بوسیله چندین ژن کنترل میشود [۱۹]. امروزه از جهش و روش های انتقال ژن و کشت بافت جهت بهبود کیفیت کنجاله کلزا و کاهش میزان گلوکوزینولاتها استفاده می شود [۸۵].
۲-۱۵-۴- بهبود عملکرد
برای بررسی عملکرد دانه، لازم است که ساختار عملکرد و مؤلفههای اولیه و ثانویه که عملکرد دانه را تعیین میکنند شناخته شود. توزیع یکنواخت بوتهها در واحد سطح پیش نیاز پایداری عملکرد است. تعداد غلاف در بوته عامل تعیین کننده در عملکرد دانه گیاه کلزا است که بیشتر با قابلیت زنده ماندن شاخه ها، جوانهها، گلها و غلافهای جوان در مقایسه با تعداد بالقوه گلها و غلافها تعیین میشود. تعداد دانه در غلاف با طول غلاف همبستگی دارد، بنابراین طول غلاف میتواند برای انتخاب غیرمستقیم در اصلاح برای بهبود عملکرد کلزا استفاده شود [۸۳].
بهنژادگران با انتخاب مستقیم و یا غیرمستقیم عملکرد دانه را بهبود میبخشند [۵]. در ارزیابی لاینها و ارقام، عملکرد دانه به عنوان صفت اصلی مورد ارزیابی قرار میگیرد، ضمن اینکه جهت ایجاد ارقام پرمحصول میتوان صفات نامطلوب گیاه از جمله حساسیت به بیماریها، ورس، طول دوره رویش و غیره را رفع نمود [۸۶]. جهت بهبود عملکرد دانه کلزا مانند سایر گیاهان باید نسبت به بهبود اجزای عملکرد مبادرت ورزید.
۲-۱۵-۵-اصلاح برای مقاومت به بیماریها و آفات
اصلاحگران همواره به دنبال دستیابی به منابع مقاومت در برابر بیماریها، آفات، خشکی، شوری، سرما و غیره بودهاند و امروزه با گسترش استفاده از ارقام کانولا (دوصفر) به نظر میرسد آسیبپذیری ارقام، مخصوصاً به بیماریها نیز بیشتر شده است. به عنوان مثال بیماری پوسیدگی اسکلروتینایی در اغلب مناطق ایران مشکل آفرین شده است [۸۶]. انتقال ژنها از گونههای دیگر امیدهایی را برای اصلاح ارقام مقاوم به این بیماری پدید آورده است. جهت مقابله با بیماری شانکر ساقه که از مهمترین بیماریهای کلزا است، منابع مقاومت به واریتههای تجاری انتقال یافته است [۸۹]. ژنهای مقاومت از گونه B. juncea منتقل گردیده است که امید میرود گیاه را در مقابل این بیماری مصون نماید [۷۶]. در مورد مقاومت به حشرات تنها نقطه امید، انتقال ژنهایی است که باعث تولید مواد دافع حشرات میشود [۸۲].
۲-۱۵-۶- اصلاح صفات زراعی
برنامههای بهنژادی فراوانی در جهت بهبود خصوصیات زراعی در کلزا در حال انجام است [۶۱]. صفات زراعی مطلوب در برنامههای اصلاحی کلزا عبارتند از رشد اولیه سریع، زودرسی، ساقه کوتاه و ضخیم،گلهای بدون گلبرگ، بهبود ریزش دانهها، طویل شدن غلافها و عمودی قرار گرفتن آنها، و افزایش تعداد غلاف در ساقه اصلی [۱۵۴]. فقدان گلبرگ در کلزا باعث دوام برگها و در نتیجه رشد ریشه و جذب آب از اعماق میشود [۲۸]. از طرفی وجود گلبرگها و ریزش آنها به روی برگها، محیط مناسبی را برای رشد قارچها تأمین میکند. عدم وجود گلبرگ همچنین کارایی جذب نور را در خانواده Brassicaceae افزایش میدهد [۳۰]. کاهش ارتفاع بوته چون با افزایش شاخص برداشت و عدم خوابیدگی همراه است، از نظر بهنژادی دارای اهمیت است.
ریزش دانه، یکی از مشکلات عمده در گونه B. napus میباشد. دو گونه B. junceaو B. rapa ریزش دانه کمتری نسبت به B. napus دارند. خوشبختانه در گونه B. napus منابع ژنی خوبی برای مقاومت به ریزش یافت شده است.[۱۶۹].